Toll样受体2(TLR2)在系统性红斑狼疮发病机制中的作用及其分子机制

【摘要】系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)是一种经典的自身免疫性疾病,可导致全身多个脏器系统受累,严重损害患者的健康和生活质量。目前,系统性红斑狼疮的发病机制尚未完全明确,研究表明,固有免疫系统的紊乱在自身免疫性疾病,包括系统性红斑狼疮,的发病机制中起着重要作用。Toll样受体2(Toll-likereceptor2,TLR2)是一种模式识别受体,既可识别外源性的病原体相关分子模式也可识别内源性的损害相关分子模式,TLR2的激活参与了免疫反应的启动与维持。有研究指出,TLR2在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞上的表达上调。因此,我们推测激活TLR2可能在系统性红斑狼疮发病过程中起到重要作用。本研究通过以下三个部分证实TLR2激活在系统性红斑狼疮发病中的作用并探讨其分子机制：第一部分,检测SLE患者CD4+T细胞表面TLR2的表达水平；第二部分,探讨TLR2激活对SLE患者CD4+T细胞自身免疫性与炎症反应的影响；第三部分,研究TLR2激活后调控炎症因子IL-17a和IL-17f表达的分子机制。通过这些研究揭示TLR2在系统性红斑狼疮发病中的作用,为SLE的治疗寻找新的有效途径提供理论依据。第一章SLE患者CD4+T细胞TLR2表达水平目的：探讨SLE患者CD4+T细胞TLR2表达水平的改变。方法：密度梯度离心法分离8例SLE患者和6例正常人外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选CD4+T细胞,实时定量PCR法检测TLR2mRNA水平。流式细胞仪检测19例SLE患者和14例正常人外周血CD4+T细胞表面TLR2蛋白表达水平。结果：与正常对照比较SLE患者CD4+T细胞中TLR2mRNA水平显著升高(3.684±0.3849vs17.53±2.795,P=0.0012)。流式细胞检测结果显示,与正常对照组(2.421±0.9032)比较,SLE患者治疗组(9.581±1.3728)和未治疗组(8.867±1.2992)CD4+T细胞中TLR2蛋白表达水平均显著上调(P=0.0002；P=0.032)。而药物治疗对SLE患者TLR2蛋白表达水平未产生显著影响(P=0.803)。结论：SLE患者CD4+T细胞中TLR2mRNA水平和蛋白水平均较正常对照升高,TLR2的激活可能参与SLE的发病机制。第二章TLR2激活在CD4+T细胞自身免疫反应中的作用第一节TLR2激活后上调CD4+T细胞自身反应性及细胞因子的分泌目的：探讨TLR2激活后对CD4+T细胞自身反应及细胞因子分泌的调控。方法：密度梯度离心法分离3例SLE患者外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选CD4+T细胞体外培养并分为实验组和对照组。实验组中加入TLR2激动剂Pam3CSK45ul(1mg/ml),对照组中加入5ulPBS。培养72小时后,采用流式细胞计数检测CD4+T细胞表面CD40L、CD70和CDlla的表达。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液上清中炎症因子IL-6,IL-10,IL-17a,TNF-α,IFN-γ的表达水平。结果：与对照组比较,TLR2激活后CD4+T细胞表面CD40L(0.017±0.0015vs0.031±0.0030,P=0.0163、CD70(0.033±0.0032vs0.050±0.0052,P=0.0088)的表达显著升高。CD11a的表达无显著差异(0.917±0.0088vs0.963±0.0088,P=0.1181)。培养液上清中IL-6(353.69±10.66vs1171.09±15.18,P=0.0005),IL-17a(30.06±0.32vs106.45±6.64,P=0.007)和TNF-α(2503.16±35.51vs4906.58±33.65,P=0.000)的表达水平显著增高,IL-10(151.2±6.535vs195.6±18.52,P=0.087)和IFN-γ(61.76±0.13vs61.18±0.21,P=0.0786)的表达无统计学差异。结论：TLR2激活后上调CD4+T细胞表面自身免疫相关基因CD40L和CD70的表达,增强了CD4+T细胞的自身反应性；升高了IL-6,IL-10,IL-17a和TNF-α等细胞因子的表达,增强了SLE患者CD4+T细胞的炎症反应。第二节TLR2激活对foxp3表达抑制及白介素17(interleukin17,IL-17)分泌促进作用目的：探讨TLR2激活对foxp3和IL-17表达的影响。方法：密度梯度离心法分离3例SLE患者外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选CD4+T细胞体外培养并分为实验组和对照组。实验组中加入TLR2激动剂Pam3CSK45ul(1mg/ml),对照组中加入5ulPBS。培养72小时后,采用实时定量PCR法检测细胞中foxp3,IL-17a,IL-17fmRNA的表达水平。结果：与对照组比较,TLR2激活后CD4+T细胞foxp3mRNA表达下调(P=0.0255),IL-17amRNA(0.0234)和IL-17fmRNA(P=0.0432)表达升高。结论：TLR2激活可抑制foxp3的表达并促进白介素17(interleukin17,IL-17)分泌。调节性T细胞功能抑制及Th17细胞过度分化可能与TLR2激活有关。第三章TLR2调控IL-17a和IL-17f表达的表观遗传学机制目的：探讨TLR2激活后对IL-17a和IL-f启动子区组蛋白修饰的影响。方法：密度梯度离心法分离3例SLE患者外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选CD4+T细胞体外培养并分为实验组和对照组。实验组中加入TLR2激动剂Pam3CSK45ul(1mg/ml),对照组中加入5u1PBS。培养72小时后,使用染色质免疫共沉淀ChIP-PCR检测IL-17a和IL-f启动子区组蛋白修饰情况。结果：与对照组比较,TLR2激活后IL-17a启动子区组蛋白H3K4三甲基化水平升高(P=0.0196),H3K9三甲基化水平下降(P=0.0158),H3乙酰化水平无显著差别(P>0.05),H4乙酰化水平升高(P=0.0317)。IL-17f启动子区组蛋白H3K4三甲基化水平无统计学差别,H3K9三甲基化水平下降(P=0.0044),H3乙酰化水平无显著差别(P>0.05),H4乙酰化水平显著升高(P=0.0002)。结论：TLR2激活后可通过调节启动子区组蛋白修饰上调炎症因子IL-17a,IL-17f的表达。
【作者】刘昱；
【导师】陆前进；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】系统性红斑狼疮；TLR2；IL-17；组蛋白修饰；

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