鞘磷脂类信号通路在慢性心功能不全中的作用与机制研究

【摘要】研究背景：慢性心功能不全是一种由于各种器质性或功能性心脏疾病,损害心室的充盈或射血能力而导致的一种复杂的临床综合征,是各种心血管疾病的终末状态。随着心血管危急重症治疗水平的提高,各种心血管疾病患者的生存时间延长,进入慢性心功能不全的患者逐年增加。目前,慢性心功能不全已经成为心血管疾病患者死亡的最主要原因。多种神经体液因素对慢性心功能不全患者病情进展起到了调节作用,其中持续性的慢性炎症反应及心肌细胞进行性凋亡被认为是慢性心功能不全发展预后的重要机制。进一步研究慢性心功能不全的这些病理生理机制与患者临床表现及预后的关系,对控制患者发病率和死亡率具有重要意义。鞘磷脂类是由一分子长链脂肪酸、一分子鞘氨醇或其衍生物及一分子极性头醇组成,其主要包括鞘磷脂、鞘糖脂及神经节苷脂三大类。其中鞘磷脂是动物细胞膜及其他各种生物膜的主要组成部分。鞘磷脂可以被鞘磷脂酶水解,生成神经酰胺等一系列生物活性脂。神经酰胺作为细胞第二信使,在心血管系统可以产生多样的生物学效应：(1)诱导包括平滑肌及心肌细胞在内的各种细胞凋亡；(2)调节平滑肌细胞的分化和增殖；(3)调节免疫功能和炎症反应；(4)参与氧化应激。Doehne推测并初步证实了分泌型酸性鞘磷脂酶在慢性心衰患者血浆中活性增高,但其生物活性产物神经酰胺在心衰患者的作用尚不明确,且鞘磷脂类信号通路激活与凋亡是否存在相关性并未阐明。因此,本项目拟在慢性心功能不全患者中探讨鞘磷脂类信号通路所含主要成分鞘磷脂酶、鞘磷脂、神经酰胺在心功能不全中的水平变化及与心功能、炎症以及凋亡指标之间相关性。此外,行离体大鼠心肌再灌注实验,通过中性神经酰胺酶预适应及后适应,进一步探讨鞘磷脂类信号通路在缺血再灌注损伤所致心功能损害及细胞凋亡中的作用及其机制。本项目有助于阐明鞘磷脂类信号通路致慢性心功能不全的作用,为慢性心功能不全的防治提供了新的理论依据。第一部分慢性心功能不全患者血浆鞘磷脂类变化及相关性研究目的：本研究旨在观察慢性心功能不全患者血浆中鞘磷脂(sphingomyelin,SPM)、神经酰胺(Ceramide)及分泌型酸性鞘磷脂酶(secretoryacidsphingomyelinase,S-ASMae)活性的变化并探讨其与慢性心功能不全症状严重程度及预后的相关性。方法：本研究纳入了423名慢性心功能不全患者及104名健康人,收集相关临床资料,完善心脏彩超并采静脉血完善相关检测,之后从入选之日开始随访患者全因死亡率至2014年3月。采用化学发光法检测SPM水平；采用液相色谱-质谱联用分析法(LS-MS)检测Ceramide水平；采用高效液相色谱法(high-performanceliquidchromatographicassay,HPLC)检测血浆中S-ASMase活性；采用酶联免疫法(ELISA法)检测血浆肿瘤坏死因子-a(turnernecrosisfactor-a,TNF-a)、可溶性FAS(sFas)、可溶性Fas配体(sFasL)及氨基末端脑钠肽前体(amino-terminalpro-brainnatriureticpeptide,NT-proBNP)水平；采用透射比浊法检测血清超敏C反应蛋白(hsCRP)水平；行心脏彩超记录左室射血分数(leftventricularejectfraction,LVEF)及左室舒张末期内径(leftventricularend-diastolicdimension,LVED)。比较不同心功能分级患者及正常对照组血浆中SPM、Ceramide.TNF-α、hsCRP、NT-proBNP、S-ASMase活性的变化,结合患者一般临床资料结果进行相关性分析；根据Ceramide水平将患者以三分位分组,应用Kaplan-Meier分析比较三组生存率,行Cox比例风险模型评价患者死亡率相关风险因素。结果：(1)慢性心功能不全患者血浆SPM、Ceramide、TNF-α、hsCRP、sFas、NT-proBNP、LVED及S-ASMase活性较正常组升高(P<0.05),SBP、DBP、LVEF较正常组降低(P<0.05)；不同NYHA心功能分级慢性心功能患者组之间,服药情况无明显统计学差异；(2)血浆Ceramide水平随着NYHA心功能分级逐级上升,各组间差异均具有统计学意义(P<0.05)；(3)血浆Ceramide水平与LVED、NT-proBNP、TNF-α、sFas、S-ASMase呈显著正相关(P<0.05),与LVEF呈显著负相关(P<0.05)；(4)经过平均4年(四分位数间距：3.4-5.3年)的随访,423名患者中失访人数13人,200患者死亡,累积死亡率47.2%,Ceramide水平最高组患者的死亡风险约为最低组的2.5倍(HR:2.48,95%CI:1.74-3.55,P<0.001)；(5)Cox回归分析发现,BMI,LVEF,Log(NT-proBNP),并发心房颤动,以及Ceramide水平均是慢性心功能不全患者死亡的独立预测因子。结论：血浆Ceramide随着慢性心功能不全疾病严重程度增加而升高,并且是预测慢性心功能不全患者死亡率的独立风险因子,提示鞘磷脂类信号通路在慢性心功能不全发生发展中起到了重要的作用。第二部分鞘磷脂类信号通路在大鼠心脏缺血再灌注损伤中的作用及机制探讨目的：观察鞘磷脂酶(sphingomyelinase,SMase)活性、神经酰胺酶(ceramidase,CDase)活性、神经酰胺及鞘氨醇水平在心肌缺血-再灌注损伤中的变化,以及中性神经酰胺酶(NCDase)干预对其的保护作用。方法：32只SpragueDawley(SD)大鼠随机分为4组：正常对照组(Control)、缺血再灌注组(IR)、CDase预适应组(ischemicpreconditioning,IPC)、CDase后适应组(ischemicpostconditioning,IPost),每组8只。离体心脏,置于Langendorff装置,以95%02和5%C02混合气体饱和的K-H缓冲液(Krebs-Henseleit,K-H)恒温(37℃)持续灌注30min后,根据分组行相应处理。Control组：持续灌注150min；IR组：停灌30min,K-H液再灌120min;CDase预适应组：含CDase的K-H液灌流10min,停灌30min,复灌120min；CDase后适应组：停灌30min,应用含CDase的K-H液灌流10min,之后再用常规K-H液灌流110min。灌注期间监测心率(HR)、左室内压(LVP)、左室压力最大上升/下降速率(±dP/dtmax)左室舒张末压(LVEDP)及冠脉流量(CF),IR组及CDase预适应组复灌5min时,后适应组复灌15min时,留取冠脉流出液5ml,待测肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)水平；留取各组完成灌注的心脏,测量心肌梗死面积,心肌组织石蜡切片HE染色,并行组织匀浆检测ASMae活性、NSMase活性、NCDase活性、ACDase活性、神经酰胺及鞘氨醇水平。结果：(1)IPC组和IPost组显著降低心脏缺血再灌注后LVP、+dP/dtmax及-dP/dtmax,显著增加LVEDP(P<0.05);HR.CF无明显统计学差异:(2)与对照组相比,R组、IPC及IPost组大鼠离体心脏梗死面积、灌流液CK及LDH水平显著增加(P<0.05),而与IR组相比,IPC及IPost组大鼠离体心脏梗死面积、灌流液CK及LDH显著降低(P<0.05)；(3)与Control组相比,IR组心脏组织匀浆中ASMase活性、NSMase活性及神经酰胺水平显著升高(P<0.05),NCDase活性显著降低(P＜0.05),IPC组及IPost组ASMase活性、NSMase活性、NCDase活性及鞘氨醇水平显著增高(P<0.05)；与IR组相比,IPC组及IPost组心脏组织匀浆中ASMase活性、NSMase活性及神经酰胺水平显著降低(P<0.05),NCDase活性及鞘氨醇水平显著升高(P＜0.05);IPC组与IPost组之间心脏组织匀浆中各指标水平均无明显统计学差异。各组间鞘磷脂水平及ACDase活性无显著统计学差异。结论：心脏缺血再灌注损伤通过上调ASMase活性及NSMase活性,同时下调NCDase活性,导致心肌中神经酰胺水平增加,最终引起心脏细胞破坏,梗死面积增加,心脏舒缩功能减退,而予以NCDase预适应及后适应可以明显逆转缺血再灌注损伤,提示鞘磷脂类信号通路参与缺血再灌注损伤的病理生理机制,其可能成为心肌梗死后心功能不全新的治疗靶点。
【作者】潘玮；
【导师】张国刚；
【作者基本信息】中南大学，内科学，2014，博士
【关键词】鞘磷脂酶；神经酰胺；肿瘤坏死因子；细胞凋亡；慢性心功能不全；酸性鞘磷脂酶；酸性神经酰胺酶；鞘氨醇；缺血再灌注损伤；

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