体外受精—胚胎移植中影响子宫内膜异位症患者妊娠结局的相关因素分析及GDF-9在子宫内膜异位症患者卵泡液和颗粒细胞中的表达

【摘要】子宫内膜异位症（endometriosis,EMs）是指子宫内膜组织（腺体和间质）出现在子宫腔以外的任何部位而引起的一种疾病，为育龄妇女常见病、多发病，是引起女性不孕的常见原因之一。体外受精-胚胎移植（invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET）技术的应用成为解决不孕症的有效方法，但与其他因素不孕行IVF-ET治疗的患者相比，子宫内膜异位症较差的妊娠结局给患者带来很大的精神压力和经济负担。子宫内膜异位症导致IVF-ET不良结局的因素纷繁复杂，包括生殖内分泌系统调节、卵子质量、胚胎发育、胚胎植入及内膜容受性改变等方面。目前很多研究已经从上述层面分析了子宫内膜异位症与IVF-ET妊娠结局的关系，而其中卵母细胞质量下降是影响其治疗结局的关键因素之一。卵母细胞的质量体现了卵子内在的发育潜能，质优的卵母细胞在正常受精、胚胎发育及着床的过程中起到至关重要的作用，并且对妊娠的建立和维持、胎儿的发育也具有深刻影响，因此在IVF-ET中努力提高卵母细胞质量意义重大。卵母细胞的发育包括生长和成熟两个阶段，其成熟与卵泡的生长相伴进行。同时，卵母细胞通过广泛的缝隙连接，局部因子的自分泌及旁分泌功能与周围的颗粒细胞进行信息交流，构成统一的整体。因此，从卵泡液的成分及颗粒细胞方面对卵母细胞质量进行研究评估引起广泛关注，而卵母细胞分泌因子（Oocytesecretedfactors,OSFs）的发现又为研究卵母细胞质量、预测胚胎质量及妊娠结局提供了新的思路。在众多卵母细胞因子中，生长分化因子-9（growthdifferentiationfactors,GDF-9）是最早被发现对卵泡发育具有重要作用，并且有研究发现，以正常妇女作对照，严重子宫内膜异位症妇女经腹腔镜穿刺大卵泡的卵泡液中，GDF-9水平下降明显。综上所述，本研究第一部分通过回顾因子宫内膜异位症因素行IVF助孕患者的临床及实验室资料并与单纯因输卵管因素不孕者进行比较，探讨影响子宫内膜异位症IVF-ET结局的相关因素；第二部分通过测定子宫内膜异位症患者血清、卵泡液中GDF-9水平及黄素化颗粒细胞上GDF-9的蛋白及mRNA的表达，探讨GDF-9与子宫内膜异位症的关系，力图探索其影响卵母细胞质量的可能途径，以期为指导临床治疗提供理论依据及新思路。第一部分体外受精-胚胎移植中影响子宫内膜异位症患者妊娠结局的相关因素分析目的：回顾性分析因子宫内膜异位症行体外受精-胚胎移植助孕患者的临床及实验室资料，并与单纯因输卵管因素者进行比较，探讨影响子宫内膜异位症IVF-ET结局的相关临床和实验室因素。方法：对河北医科大学第二医院生殖医学科2011年1月至2013年3月行常规IVF周期的患者，根据病因不同将子宫内膜异位症组作为实验组（A组）、单纯因输卵管因素不孕者为对照组（B组）；其中又根据妊娠结局将A组分为妊娠组（A1组）、非妊娠组（A2组）。A组共129个周期，移植周期为114例，其中A1组60例，A2组54例；B组共1660个周期。①比较A、B两组患者的一般资料如年龄，不孕年限，体重指数（BMI），血清基础卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）水平，原发不孕与继发不孕比例；②比较A、B两组促排卵方案的构成比，促性腺激素（Gn）使用天数及用药量，人绒毛膜促性腺激素（HCG）注射日（以下简称HCG日）血清LH、E2、孕酮（P）水平；③比较A、B两组平均获卵数、受精率、正常受精率、卵裂率、可移植胚胎数、移植胚胎数、优质胚胎数、周期冷冻率，全胚冷冻率；④比较A、B两组胚胎种植率及临床妊娠率、多胎率及流产率。⑤比较A1、A2两组患者年龄、不孕年限、原发和继发不孕比例、基础性激素水平、使用Gn天数及用量、HCG日LH、E2、P水平以及各种方案构成比；⑥比较A1、A2两组平均获卵数、受精率、正常受精率、卵裂率、可移植胚胎数、优质胚胎数、周期冷冻率等。结果：1789个IVF周期中，子宫内膜异位症组共129个周期（A组），对照组1660个周期（B组）。①A、B两组患者的平均年龄分别为31.29±4.31岁、29.21±4.04岁，A组显著高于B组，两组比较差异有统计学意义（Z=-5.275，P<0.05）；A、B两组患者的不孕年限分别为4.57±3.99年、3.80±2.73年，两组比较差异有统计学意义（Z=-2.064，P<0.05）；A、B两组患者原发不孕的比例分别为62.80%、52.53%，两组比较差异有统计学意义（χ2=5.035，P<0.05）；A、B两组血清基础FSH、LH水平分别为8.18±3.12mIU、3.95±1.79mIU和7.88±3.73mIU、4.74±3.22mIU，两组比较差异均无统计学意义（Z=-1.145，P>0.05；Z=1.176，P>0.05）；A、B两组血清基础E2水平为57.47±53.01pg/ml、44.92±32.32pg/ml，两组比较差异有统计学意义（Z=-3.011，P<0.05）；②A、B两组患者促排卵方案（长方案、短方案、拮抗剂方案、超长方案）的构成比分别为26.3%、4.7%、10.9%、58.1%和78.4%、5.2%、12.9%、3.4%，两组比较差异有统计学意义（χ2=529.442，P<0.05）；A、B两组的Gn天数与Gn用量分别为10.78±2.25天、2896.90±824.71IU和10.13±2.12天、2375.85±764.96IU，两组比较差异均有统计学意义（Z=-3.610，P<0.05，Z=-7.548，P<0.05）；A、B两组患者的HCG日血清LH、E2、P水平分别为1.69±1.77mIU/ml、2543.88±1547.71pg/ml、1.04±0.56ng/ml和2.23±2.54mIU/ml、3407.31±1444.48pg/ml、1.17±0.69ng/ml，两组比较LH、E2及P水平差异均有统计学意义（Z=5.715，P<0.05；Z=6.16，P<0.05；Z=2.430，P<0.05）；③A、B两组患者的平均获卵数分别为9.69±7.17枚、13.67±7.83枚，两组比较差异有统计学意义（Z=6.508，P<0.05）；A、B两组患者的受精率和正常受精率分别为73.60%、60.08%和84.32%、63.54%，两组比较差异均有统计学意义（χ2=100.131，P<0.05；χ2=6.130，P<0.05）；A、B两组患者的卵裂率分别为98.91%、98.90%，两组比较差异无统计学意义（χ2=3.617，P>0.05）；A、B两组患者的优质胚胎数分别为2.39±3.32个、3.86±3.91个，两组比较差异有统计学意义（Z=4.712，P<0.05）；A、B两组患者的可利用胚胎数分别为4.01±3.82个、5.94±4.27个，两组比较差异有统计学意义（Z=5.740，P<0.05）；A、B两组移植胚胎数分别为2.00±0.51个、1.70±0.89个，两组比较无统计学差异（Z=0.634，P>0.05）；A、B两组挽救ICSI（rescueICSI,R-ICSI）率分别为2.29%、2.97%，两组比较差异无统计学意义（χ2=0.324，P>0.05）；④A、B两组患者的周期冷冻率分别为44.96%、64.76%，两组比较差异有统计学意义（χ2=20.203，P<0.05），但两组的全胚冷冻率分别为10.08%、16.20%，比较差异无统计学意义（χ2=3.216，P>0.05）；A、B两组胚胎种植率及临床妊娠率分别为35.65%、52.63%和36.69%、53.89%，A组低于B组，但差异均无统计学意义（χ2=0.068，P>0.05；χ2=0.099，P>0.05）；A、B两组的多胎率分别为33.33%、30.11%，两组比较差异无统计学意义（χ2=0.280，P>0.05）；A、B两组的流产率分别为11.67%、6.80%，A组高于B组，但差异无统计学意义（χ2=2.044，P>0.05）。⑤A1、A2两组平均年龄、不孕年限分别为30.33±3.72岁、3.93±2.74年和32.33±4.72岁、5.18±5.26年，两组比较差异无统计学意义（Z=1.766，P>0.05；Z=0.935，P>0.05）；A1、A2两组患者的原发不孕率为71.67%、33.33%，A1组显著高于A2组，两组比较差异有统计学意义（χ2=16.788，P<0.05）；A1、A2两组血清基础FSH、E2水平分别为8.31±3.30mIU、59.46±62.22pg/ml和8.74±3.27mIU、55.15±51.52pg/ml，两组比较差异均无统计学意义（Z==1.086，P>0.05；Z=-0.738，P>0.05）；两组基础LH水平为3.55±1.75mIU、4.31±1.91mIU，两组比较，差异有统计学意义（t=-2.082，P<0.05）；A1、A2两组平均使用Gn天数分别为10.17±3.84天、10.29±2.54天，两组比较差异无统计学意义（Z=-0.609，P>0.05）；A1、A2两组平均Gn用药量分别为2699±676.91IU、3132.1±923.58IU，A1组少于A2组，两组比较差异有统计学意义（t=-2.758，P<0.05）；A1、A2两组HCG日E2水平为2691.90±1415.73pg/ml、2191.22±1513.05pg/ml，A1组显著高于A2组，两组比较差异有统计学意义（Z=-2.018，P<0.05）。⑥A1、A2两组的平均获卵数、优质胚胎数、可移植胚胎数分别为9.50±5.18枚、2.68±2.90个、4.30±3.00个和7.72±5.14枚、1.38±1.83个、2.81±2.12个，A1组均高于A2组，两组比较差异有统计学意义（Z=-2.364，P<0.05；Z=-2.401，P<0.05；Z=-3.023，P<0.05）；A1、A2两组受精率、正常受精率分别为74.56%、61.75%和74.10%、58.03%，A1组虽均高于A2组，但两组相比差异无统计学意义（χ2=0.027，P>0.05；χ2=1.391，P>0.05）；A1、A2两组卵裂率为98.82%、98.06%，两组比较差异无统计学意义（χ2=0.710，P>0.05）；两组周期冷冻率为53.33%、24.07%，A1组显著高于A2组，两组相比差异有统计学意义（χ2=10.184，P<0.05）。结论：子宫内膜异位症患者年龄偏大，不孕年限长，原发不孕比例高，在卵巢刺激中对促排卵药物反应性差以及卵母细胞的受精异常，这些因素可能导致了临床妊娠率、种植率偏低，流产率偏高；子宫内膜异位症中临床妊娠者具有对促排卵药物反应性好、胚胎质量优的特点。第二部分GDF-9在子宫内膜异位症患者卵泡液和颗粒细胞中的表达目的：通过测定GDF-9在子宫内膜异位症患者卵巢刺激中血清、卵泡液中的水平及黄素化颗粒细胞上GDF-9蛋白及其mRNA的表达，探讨GDF-9与子宫内膜异位症患者卵母细胞质量和IVF妊娠结局的关系，寻找其影响卵母细胞质量的可能途径。方法：收集于2012年8月至2013年3月在河北医科大学第二医院生殖医学科行体外受精-胚胎移植的子宫内膜异位症患者30例（A组）的血清、卵泡液及黄素化颗粒细胞，同时以同期单纯因输卵管不孕患者30例（B组），作为对照组。比较两组一般指标如年龄、基础性激素水平（FSH、LH、E2）、Gn天数及用量、平均获卵数、平均受精率、平均正常受精率、平均卵裂率、可移植胚胎数（率）、优质胚胎数（率）、胚胎种植率及临床妊娠率等；用酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）测定两组血清、卵泡液中GDF-9水平；蛋白印记法测定两组黄素化颗粒细胞中GDF-9蛋白表达；逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptase-polymerasechainreaction,RT-PCR）测定颗粒细胞上GDF-9mRNA表达；比较两组血清、卵泡液中GDF-9水平、黄素化颗粒细胞中GDF-9蛋白及mRNA的表达；分析血清、卵泡液GDF-9水平、黄素化颗粒细胞中GFDF-9蛋白及mRNA表达与年龄、Gn天数及用量、获卵数、可移植胚胎数（率）、优质胚胎数（率）、受精率、卵裂率等的相关性。结果：子宫内膜异位症组共30个周期（A组），对照组30个周期（B组）。①A、B两组女方的平均年龄分别为31.50±4.83岁、28.15±4.27岁，A组显著高于B组，两组比较差异有统计学意义（Z=-3.080，P<0.05）；A、B两组血清基础FSH、LH、E2水平分别为8.31±3.62mIU、4.30±1.78mIU、58.88±49.27pg/ml和7.34±1.69mIU、4.42±1.76mIU、43.72±36.81pg/ml，两组比较差异均无统计学意义（Z=-0.412，P>0.05；t=-0.249，P>0.05；Z=-1.224，P>0.05）；②A、B两组的Gn天数与Gn用量分别为11.17±1.42天、3010.83±655.19IU和9.55±1.28天、2184.20±580.00IU，两组比较差异均有统计学意义（Z=-4.080，P<0.05；Z=-4.699，P<0.05）；A、B两组患者的HCG日LH、E2水平分别为1.38±1.20mIU/ml、3066.37±1612.51pg/ml和2.02±1.26mIU/ml、3846.06±1216.97pg/ml，A组均低于B组，两组比较差异均有统计学意义（Z=3.142，P<0.05；Z=2.016，P<0.05）；但A、B两组患者的HCG日P水平分别为1.18±0.47ng/ml、1.14±0.69ng/ml，两组比较差异无统计学意义（Z=0.606，P>0.05）；③A、B两组患者的平均获卵数、优质胚胎数、可移植胚胎数分别为10.63±8.10枚、3.27±4.82个、4.47±4.90个和15.15±8.23枚、5.28±5.12个、7.03±5.46个，A组均低于B组，两组比较有统计学差异（Z=-2.792，P<0.05；Z=-2.295，P<0.05；Z=-2.380，P<0.05）；A、B两组平均受精率为81.63%±15.72%、77.84%±17.52%，两组比较，差异无统计学意义（Z=-0.700，P>0.05）；A、B两组平均正常受精率分别为55.93%±22.05%、67.34%±15.67%，A组低于B组，两组比较差异有统计学意义（t=-2.331，P<0.05）；A、B两组患者的平均卵裂率分别为97.46%±9.74%、97.67%±5.73%，两组比较差异无统计学意义（Z=-1.351，P>0.05）；A、B两组移植胚胎数分别为1.73±0.94个、1.76±0.79个，两组比较差异无统计学意义（Z=0.142，P>0.05）；④A、B两组的周期冷冻率分别为40%、66.66%，A组显著低于B组，两组比较差异有统计学意义（χ2=20.203，P<0.05），但两组的全胚冷冻率分别为13.33%、15.15%，两组比较差异无统计学意义（χ2=0.042，P>0.05）；A、B两组胚胎种植率分别为30.77%、34.48%，临床妊娠率分别为53.33%、60.60%，多胎率分别为60%和66.67%，流产率分别为20.00%、8.33%，两组比较差异均无统计学意义（χ2=0.172，P>0.05；χ2=0.063，P>0.05；χ2=0.105，P>0.05；χ2=0.630，P>0.05）；⑤A、B两组取卵日的血清、卵泡液中GDF-9的水平分别为153.47±9.81pg/ml、143.00±90.28pg/ml和204.40±137.65pg/ml、236.85±163.40pg/ml，A组均明显低于B组，两组比较差异有统计学意义（Z=2.047，P<0.05；Z=2.216，P<0.05）；A、B两组黄素化颗粒细胞中GDF-9蛋白及mRNA表达分别为0.53±0.17、0.57±0.21和0.72±0.19、0.75±0.18，A组均明显低于B组，两组比较差异有统计学意义（Z=3.615，P<0.05；t=-3.699，P<0.05）；⑥A组黄素化颗粒细胞中GDF-9蛋白与与获卵数、可移植胚数、优质胚胎数呈正相关（r=0.703，P<0.05；r=0.644，P<0.05；r=0.665，P<0.05）；A组黄素化颗粒细胞上mRNA表达与与获卵数、可移植胚数、优质胚胎数呈正相关（r=0,515，P<0.05；r=0.569，P<0.05；r=0.526，P<0.05）；B组黄素化颗粒细胞上GDF-9蛋白及mRNA与受精率呈正相关，（r=0.442，P<0.05；r=0.430，P<0.05）。⑦A1、A2组血清、卵泡液中GDF-9浓度分别为191.63±102.04pg/m、196.43±116.83pg/m和134.35±95.45pg/m、124.50±99.70pg/m，A1组显著高于A2组，两组比较差异均有统计学意义（Z=-2.288，P<0.05；Z=-2.332，P<0.05）；A1、A2组黄素化颗粒细胞上GDF-9蛋白及mRNA表达水平分别为0.63±0.15、0.70±0.17和0.48±0.16、0.50±0.20，A1组均高于A2组，两组比较差异有统计学意义（t=2.485，P<0.05；Z=-2.772，P<0.05）；B1、B2两组血清、卵泡液中GDF-9浓度分别为256.52±157.45pg/ml、279.24±129.78pg/ml和172.89±119.48pg/ml、190.43±169.01pg/ml，B1组显著高于B2组，两组比较差异有统计学意义（Z=-2.156，P<0.05；Z=-2.090，P<0.05）；B1、B2两组颗粒细胞上GDF-9蛋白及GDF-9mRNA水平分别为0.76±0.22、0.68±0.22和0.70±0.17、0.78±0.14，两组比较差异无统计学意义（Z=-1.210，P>0.05；t=-1.534，P>0.05）。结论：子宫内膜异位症患者血清、卵泡液中GDF-9浓度以及颗粒细胞上GDF-9蛋白和mRNA表达水平下降，其可能通过影响卵泡发育、卵母细胞及胚胎质量，使子宫内膜异位症患者临床妊娠率、胚胎种植率偏低，流产率偏高。
【作者】曹明雅；
【导师】赵志明；
【作者基本信息】河北医科大学，妇产科学，2014，硕士
【关键词】体外受精；子宫内膜异位症；不孕；GDF-9；颗粒细胞；卵母细胞质量；胚胎质量；

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