Genistein对裸鼠卵巢癌移植瘤的影响

【摘要】目的：在妇科恶性肿瘤中死亡率最高的当属卵巢癌。因其发生发展具有隐匿性的特点，约70%的患者在发现时已属于晚期（FIGO分期IIB-IV期），其五年生存率不到40%[1]。肿瘤减灭术联合术后化疗成为卵巢癌治疗的标准方案。静脉化疗复发率较高，腹腔化疗可以延长无瘤生存期并延长总生存率，但其毒副作用较大，其应用受到限制，因此，寻找低毒有效抗癌制剂成为当前卵巢癌治疗研究的重要课题。大豆中天然存在的黄酮类化合物主要有3种，即大豆甙类（daidzin）、染料木甙类（genistin）、黄豆甙类（glycitin），其中又以染料木黄酮（genistein）含量最多，活性最强，其化学名为4,5,7-三羟基异黄酮。研究表明genistein具有多种生物学活性，如雌激素样作用、抗雌激素样作用、抗氧化和调节细胞周期等，近年来因其显著的防癌抗癌效果而倍受关注。然而genistein水溶性差，口服吸收效率较低。在绝大多数的体内外实验中通常利用二甲基亚砜（DMSO）进行溶解，但是DMSO对细胞的毒副作用不可忽视，不仅影响实验效果，而且也限制药物的临床应用。羟丙基-β-环糊精是一种无毒、刺激性小、可以供静脉注射的辅料。经羟丙基-β-环糊精包合后的黄酮类化合物，增强了药物的生物利用度，改善了溶解度及稳定性。近年来研究发现microRNAs是肿瘤形成过程的重要参与者，人类多种肿瘤的发生发展与microRNAs的异常表达有关，扮演着癌基因与抑癌基因的角色。本课题以人卵巢上皮性癌裸鼠皮下移植瘤为研究对象，利用羟丙基-β-环糊精包合的genistein，探讨Genistein对人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其对PTEN蛋白和microR-21的影响，为Genistein在上皮性卵巢癌的临床治疗及预防中的应用提供理论依据。方法：1细胞培养：人卵巢癌细胞SKOV3细胞，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养箱为温度为37℃，含5%CO2。2裸鼠移植瘤模型的建立及实验分组：实验动物为BALB/C/nu/nu无胸腺裸小鼠，5～6周龄，18-22g，雌性，在SPF级环境下饲养。常规无菌培养SKOV3细胞，当细胞长至对数期时，用0.25%胰酶对细胞进行消化，离心，配制成2.5×107个/ml单细胞悬液，在无菌条件下接种于裸鼠背部近前肢处的皮下，每只裸鼠接种0.2ml（即5×106个细胞）单细胞悬液。观察移植瘤生长情况，种瘤第7天选出移植瘤接种成功，并且移植瘤直径在4～7mm的的裸鼠进行试验，将选出的裸鼠随机分成六组:对照组（辅料组）顺铂组，Genistein包合物低剂量组，顺铂+Genistein包合物低剂量组，Genistein包合物中剂量组，Genistein包合物高剂量组，每组6只。3实验药物的制备：Genistein包合物、辅料、顺铂均由0.9%氯化钠注射液配制成所需浓度，即刻使用。4给药方法：Genistein包合物含genistein的浓度为6%，用药中低、中、高剂量分别按含genistein量50mg/kg、150mg/kg、450mg/kg腹腔注射，每天一次，连续3周；对照组（辅料组）按Genistein包合物低剂量组所含羟丙基β-环糊精量进行腹腔注射，每天一次，连续3周，顺铂组按3mg/kg腹腔注射，每天一次，连用7天，3周后处死；Genistein包合物低剂量+顺铂组同两药单独给药方法。5裸鼠重量及移植瘤体积和重量的测量：从种瘤后开始每天观察裸鼠精神状态、饮食、大便、活动及生长等情况。治疗前测裸鼠体重，移植瘤的最长径（a）和最短径（b），治疗后，每周测量裸鼠体重，移植瘤的最长径（a）和最短径（b），并按公式V（mm3）=πab2/6计算移植瘤体积。停药24小时终止观察，脱颈法处死裸鼠，剥取瘤组织，并称重。计算肿瘤抑瘤率IR（%）=（1－治疗组肿瘤平均瘤重/对照组中平均瘤重）×100%。6免疫组织化学染色检测移植瘤组织中PTEN蛋白的表达情况。7用RT-qPCR技术检测移植瘤组织中microR-21、PTENmMRA的表达。8统计学方法：采用SPSS19.0统计学软件对实验数据进行处理。等级资料按秩转换多个独立样本比较的Student-Newman-kelus检验，计量资料以析因设计和单因素方差分析进行检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果：1给药过程顺利，顺铂组及联合用药组裸鼠出现消瘦、精神状态较差，随着周龄的增加，体重有下降趋势，且与对照组相比差异均有统计学意义。其余各组裸鼠体重均有所增长，但与对照组相比，差异无统计学意义。在开始给药时，各组移植瘤体积无统计学差异，随时间延长各组瘤体积均逐渐增大，给药第22天各组移植瘤平均体积均比对照组小。处死裸鼠后各组抑瘤率分别为：联合用药组＞顺铂组＞Genistein包合物低剂量组；genistein包合物高剂量组＞中剂量组＞低剂量组。顺铂和genistein包合物虽然都能抑制肿瘤生长，但是顺铂和genistein包合物并无明显的协同作用。2裸鼠移植瘤组织中PTEN蛋白表达情况：各剂量genistein包合物均能增加PTEN蛋白表达，与对照组相比差异有统计学意义，但是顺铂组对PTEN蛋白表达则无明显影响，联合组统计结果显示genistein包合物与顺铂对PTEN蛋白表达无协同作用；与PTEN蛋白相对应的PTENmRNA结果也有上述规律。3裸鼠移植瘤组织中miR-21的表达情况：各剂量genistein包合物均能降低miR-21的表达，与对照组相比差异均有统计学意义，但是顺铂组对miR-21的表达则无明显影响，联合组统计结果显示genistein包合物与顺铂对miR-21的表达无协同作用，说明顺铂不能降低miR-21的表达。结论：1顺铂与Genistein包合物均具有抑制肿瘤生长的作用，并随genistein剂量增大抑制作用也增强，联合用药比单独用药组均能增加对肿瘤生长的抑制，但统计学分析差异并无显著性，可能与样本量较小有关。2Genistein包合物可明显增加PTEN蛋白的表达，并呈现剂量依赖性，但顺铂对PTEN蛋白表达无明显影响，且联合用药也无明显协同作用。3Genistein各剂量均可以抑制miR-21的表达，增加PTENmRNA的表达，且表现为剂量依赖性，但顺铂对miR-21及PTENmRNA的表达无明显影响，且联合用药也无明显协同作用。
【作者】王巧焕；
【导师】赵素芬；
【作者基本信息】河北医科大学，妇产科学，2014，硕士
【关键词】卵巢癌；Genistein；SKOV3；miR-21；PTEN；

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