大鼠胚胎干细胞和iPS细胞诱导分化类颗粒细胞的实验研究

【摘要】绝经是卵巢功能衰竭的结果,若女性在40岁之前绝经则称为卵巢功能早衰,在临床上主要表现为过早绝经,高促性腺激素、低雌激素血症。卵巢功能早衰的病因学至今为止仍不十分清楚,目前已知的原因有：遗传性、酶缺陷、医源性、免疫性以及感染等。卵巢早衰由于病因不明确,所以目前的治疗主要是针对性治疗为主,其中包括：激素替代治疗、辅助生殖技术的不孕症治疗和干细胞的细胞治疗技术。干细胞技术为治疗卵巢早衰患者提供了前景,不仅可以治愈由于激素下降导致的临床症状,更为广大不孕患者带来了福音。但是由于干细胞的研究还没有处于临床应用阶段,还存在伦理和免疫排斥等技术难题,这些都阻碍了该技术在临床上的广泛应用。最新发展起来的iPS技术将有可能克服胚胎干细胞在这些技术上的障碍,为干细胞的应用拓展出更大的应用前景。本论文的工作分为两部分：第一部分采用囊胚内细胞团培养的方法建立大鼠胚胎干细胞系,采用iPS技术建立大鼠诱导多能干细胞系,这两种干细胞系的建立为诱导分化颗粒细胞提供有用的研究材料；第二部分通过大鼠胚胎干细胞、iPS细胞和颗粒细胞分别共培养诱导分化产生类颗粒细胞样细胞,对挑选出的卵巢早衰相关基因在诱导分化产生的两种细胞表达情况进行探讨。实验方法和结果如下：第一部分大鼠胚胎干细胞系的建立及诱导大鼠成体细胞重编程为诱导的多能干细胞目的：建立大鼠胚胎干细胞系及大鼠iPS细胞系。方法：通过囊胚内细胞团培养法建立大鼠胚胎干细胞系；通过慢病毒载体系统导入6个转录因子：OCT4,NANOQSOX2,LIN28,C-MYC,KLF4,从而建立大鼠iPS细胞系；对建立的胚胎干细胞系和iPS细胞系鉴定其干细胞特性,方法有：碱性磷酸酶活性、SSEA-1表面标志物检测、Nanog表面标志物检测、染色体核型分析、畸胎瘤实验和未分化的细胞特异性基因检测(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)。结果：1.建立了大鼠胚胎干细胞系,该细胞碱性磷酸酶活性为阳性,细胞表面表达干细胞标志物SSEA-1和Nanog,传代过程中保持正常的大鼠染色体核型、畸胎瘤结果显示该细胞具有分化为三个胚层细胞的能力、未分化细胞特异性基因(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)在该细胞系中高表达。2.建立了大鼠iPS细胞系,该细胞碱性磷酸酶活性为阳性,细胞表面表达干细胞标志物SSEA-1和Nanog,传代过程中保持正常的大鼠染色体核型、畸胎瘤结果显示该细胞具有分化为三个胚层细胞的能力、未分化细胞特异性基因(Oct4、Sox2、Nanog、Nodal、Fgf4、Gal、Leftyb、Lin28、Gabra)在该细胞系中高表达。结论：成功建立了大鼠的胚胎干细胞系和iPS细胞系,为后续研究提供了很好的研究材料。第二部分诱导大鼠胚胎干细胞和iPS细胞向颗粒细胞分化目的：诱导大鼠胚胎干细胞及大鼠iPS细胞分化产生类颗粒细胞,探讨分化产生的细胞是否具有颗粒细胞功能。方法：通过与颗粒细胞共培养方法诱导大鼠胚胎干细胞和大鼠iPS细胞产生类颗粒细胞；雌二醇的测定检测诱导分化后的细胞分泌雌二醇的功能；荧光免疫方法检测诱导分化后细胞FSHR受体的表达情况；Real.timePCR方法检测卵巢早衰相关基因3MP15,FMR1,FSHR,INHA,AMH,NOBOX,FOXO3,EIF2B,FIGLA和GDF9在诱导分化后细胞中的表达情况。结果：1.大鼠胚胎干细胞诱导分化后产生的细胞在形态上和颗粒细胞相似；免疫荧光结果显示分化后细胞膜表面表达颗粒细胞特异性标志物FSH激素受体；雌二醇检测显示诱导分化后细胞具有颗粒细胞的重要功能分泌雌二醇。2.大鼠iPS细胞诱导分化后产生的细胞在形态上和颗粒细胞相似；免疫荧光结果显示分化后细胞膜表面表达颗粒细胞特异性标志物FSH激素受体；雌二醇检测显示诱导分化后细胞具有颗粒细胞的重要功能分泌雌二醇。3.Real.timePCR方法检测卵巢早衰相关基因BMP15,FMR1,FSHR,INHA,AMH,NOBOX.FOX03,EIF2B,FIGLA和GDF9在诱导分化后细胞中的表达情况显示:BMP15,INHA,FSHR,AMH,NOBOX,和GDF9基因在诱导分化后的大鼠iPS细胞和大鼠胚胎干细胞中都显著性高表达；FMRl基因在诱导分化后的大鼠iPS细胞中高表达,而在诱导分化后的大鼠胚胎干细胞中无差异；EIF2B和FOXO3基因在诱导分化后的大鼠iPS细胞中显著性高表达,而在诱导分化后的大鼠胚胎干细胞中微弱上调；FIGLA基因在诱导分化后的大鼠iPS细胞中表达下调,而在诱导分化后的大鼠胚胎干细胞中表达上调。结论：1.大鼠胚胎干细胞诱导分化后成功产生了类颗粒细胞,具有颗粒细胞的重要功能。2.大鼠iPS细胞诱导分化后成功产生了类颗粒细胞,具有颗粒细胞的重要功能。3.卵巢早衰相关基因3MP15,FMR1,FSHR,INHA,AMH,NOBOX,FOXO3,EIF2B,FIGLA和GDF9中,可能BMP15,INHA,FSHR,AMH,NOBOX,和GDF9基因由于在两种干细胞分化后检测表达结果一致,提示这几个基因可能在卵巢早衰机制中具有更为重要的功能,为进一步研究提供了很好的线索。
【作者】张娟；
【导师】方小玲；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】胚胎干细胞；iPS；染色体；分化；Real-timePCR；卵巢早衰；

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