三色堇F3’H的克隆分析及ANS、DFR启动子的克隆

【摘要】三色堇(Viola×wittrockianaGams.),堇菜科(Violaceae)堇菜属(Viola)二年或多年生草本植物。三色堇常见栽植于公园、花坛中,多露天栽种,在我国种植广泛,深受人们喜爱。目前植物花色素苷的分子机理是国际上的研究热点,但是对花斑的分子机理及关键基因的研究还不多见,因而对于观赏植物的花斑形成机理方面缺乏深刻认识。而花斑是影响植物观赏价值的重要因素,了解其产生的机理,对于人为控制色素在植物特定部位的表达、创造新的花卉类型具有重要意义。三色堇关于花色组成以及花色斑遗传规律研究基础较好,是理想的模式植物。本研究以三色堇为实验材料,通过RACE技术手段,获得F3’H基因全长,然后进行表达载体构建,为进一步植物转化以及表达验证研究奠定良好的基础。通过对这些结构基因的研究,探讨三色堇花色斑形成的分子机理,进而丰富植物花色素苷基因表达调控的理论。主要研究结果如下：(1)优化三色堇花瓣总RNA提取的方法,并通过对比CTAB法、改良CTAB法和SDS法提取DNA的实验,寻找适合三色堇叶片DNA提取的方法。总结出改良CTAB法提取的DNA纯度最高,且操作简便,是一种高效的三色堇叶片DNA提取方法,利于三色堇分子水平的研究工作。(2)分别以mRNA反转录的cDNA和叶片提取的DNA为模板,克隆三色堇β-actin基因,得到了599bp和1186bp的片段序列,并通过保守氨基酸序列的同源性比对,一致性达到95.66%,进一步证明actin在高等植物中的高度保守性。(3)根据F3H基因的保守序列,设计特异性引物,通过RACR技术获得3’RCAE和5’RACE基因片段,再经过软件拼接,最终获得F3’H基因的全长序列。并通过核酸序列和推导的氨基酸提交NCBI进行同源性比对,验证了该序列是三色堇F3’H基因,并对其蛋白质基本特性进行了分析。(4)通过SmaⅠ和EcoRⅠ双酶切,将F3H基因插入到表达载体pXCS-HAStrep中,成功构建了转化拟南芥的表达载体,并提取重组子质粒DNA。为进一步表达转化提供基础。(5)利用Tail-PCR的技术原理,并根据三色堇ANS和DFR基因的保守序列,分别设计3个巢式引物,进行3轮PCR反应,探索三色堇花色素合成关键结构基因ANS和DFR上游启动子的克隆方法,经琼脂糖凝胶电泳检测,得到不同大小的5’端上游片段,为进一步扩增启动子全部序列以及表达验证研究做准备。
【作者】尚啸；
【导师】王健；
【作者基本信息】海南大学，园林植物与观赏园艺，2014，硕士
【关键词】三色堇；花斑；基因；载体构建；启动子；

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