Chi-29b嵌合体在卵巢癌中的抗癌作用及机制研究

【摘要】第一部分Chi-29b嵌合体在卵巢上皮性癌细胞中的抗癌作用目的：建立一种可以将miRNA-29b分子通过肿瘤组织特异性转运方式运入肿瘤细胞,进而影响抑癌基因PTEN的重新表达,从而抑制卵巢癌生长的治疗方法。方法：构建可以靶向结合卵巢癌细胞表面MUC1蛋白的适体和miR-29b构成的嵌合体(Chi-29b)。Dicer酶体外消化Chi-29b,检测Chi-29b能否释放miR-29b。FACS法检测Chi-29b的细胞内化率。Western-blot法检测OVCAR-3细胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、PTEN蛋白表达水平,甲基化技术检测OVCAR-3细胞中PTEN启动子区的甲基化,RT-PCR检测OVCAR-3细胞中PTENmRNA表达水平,Hoechst33342法检测细胞凋亡。结果:Dicer酶能有效裂解Chi-29b嵌合体,并释放miR-29b。Chi-29b嵌合体可以通过浓度依赖的方式特异性的转运到OVCAR-3细胞中；而且当嵌合体Chi-29b浓度为250nM时,达到细胞内化的高峰拐点(81%),500nM和1000nM时的Chi-29b内化数量更多。和对照组比较,Chi-29b嵌合体可以显著下调OVCAR-3细胞中DNMT1,DNMT3A,DNMT3B的蛋白表达水平(P<0.001),诱导PTEN基因启动子甲基化低表达(P<0.01),上调PTENmRNA和蛋白表达水平(P<0.001和P<0.01),并且可以显著诱导OVCAR-3细胞凋亡(P<0.001)。结论：嵌合体Chi-29b能通过MUC1的靶向作用以浓度依赖方式进入OVCAR-3细胞；OVCAR-3细胞中,Chi-29b通过甲基化机制上调PTEN基因和蛋白表达,诱导细胞凋亡。第二部分卵巢癌中Chi-29b嵌合体的抗化疗耐药效应及机制目的：确定在卵巢癌移植模型和化疗药物耐药的卵巢癌肿瘤模型中MUC1核酸适体-miR-29b嵌合体的抗肿瘤作用,并进一步探明相关的机制。方法：构建OVCAR-3-taxol细胞亚株,MTT法检测其IC50值；将OVCAR-3-taxol细胞分别和1mg/ml紫杉醇、500nM的Chi-29b、1mg/ml紫杉醇加500nM的Chi-29b共孵育,MTT法检测细胞增殖。裸鼠右后肢皮下注射OVCAR-3、OVCA-420、OVCAR-3-taxol细胞,建立相应的异种卵巢癌移植动物模型并分组；腹腔注射Chi-29b,评价肿瘤生长情况及其对ALDH1+细胞的影响,甲基化技术检测移植瘤细胞中PTEN启动子的甲基化,RT-PCR法检测PTENmRNA及ALDH1mRNA表达水平,Western-blot法检测PTEN、MAPK4、MAPK10、IGF1、AKT、Bax及血管动蛋白的蛋白表达水平,Tunnel法检测细胞凋亡水平。结果：()VCAR-3-taxol细胞亚株的IC50值是5764±143μg/L；Chi-29b嵌合体能显著抑制体外OVCAR-3-taxol细胞增殖(P<0.001)。在OVCAR-3移植瘤中,和对照组比较,腹腔内注射Chi-29b嵌合体能显著抑制肿瘤生长(p<0.001),显著上调PTENmRNA表达(p<0.001),显著下调PTEN甲基化和MAPK4、IGF1蛋白的表达水平(p<0.001)；然而在OVCA-420移植瘤中,Chi-29b通过下调MAPK4、MAPK10和IGF1蛋白表达而抑制肿瘤生长(p<0.01),但不影响PTEN基因的表达。在OVCAR-3-taxol移植瘤中,和对照组比较,腹腔注射Chi-29b嵌合体能显著抑制肿瘤生长和增加肿瘤细胞凋亡(p<0.001),显著上调PTENmRNA、PTEN和Bax蛋白表达水平(p<0.001),显著下调Akt、MAPK4、MAPK10和IGF1蛋白表达水平(p<0.001)。OVCAR-3-taxol移植瘤中的ALDH1mRNA显著高于OVCAR-3移植瘤中的表达水平(p<0.001)；腹腔内注射Chi-29b嵌合体能显著降低这两种移植瘤中的ALDH1mRNA表达水平(p<0.001)和OVCAR-3-taxol移植瘤中的ALDH1+细胞数(p<0.001)。结论：Chi-29b在卵巢癌及卵巢癌耐药的动物模型中均能发挥有效的抗肿瘤作用；卵巢癌耐药细胞的产生和ALDH1阳性细胞增加有关；Chi-29b通过抑制肿瘤干细胞活性发挥抗卵巢癌耐药的作用；Chi-29b通过调节PTEN-Akt-Bax及MAPK和IGF信号途径抑制卵巢癌的生长,并且可能和ALDH1有关。
【作者】戴芙蓉；
【导师】张怡；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】卵巢癌；适体；miRNA；PTEN；嵌合体；甲基化；肿瘤干细胞；动物模型；

【参考文献】
[1]江芷倩.中国概念股财务舞弊影响因素及信号策略的实证研究[D].厦门大学,财务学,2014,硕士.
[2]钱泉.微电影的发展现状及问题对策研究[D].云南师范大学,广播电视艺术学,2013,硕士.
[3]中国工业报记者陈祎淼.解症结破难题业界支招化工新材料发展[N].中国工业报,2015-05-26A03.
[4]胡经畲.结合航天工程实际——一谈开展可靠性增长试验的经验体会[J].质量与可靠性.2000(06)
[5]郑玉兰.复脉颗粒对心房颤动患者心房重构的临床疗效研究[D].广州中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[6]宫泽龙.道路景观连续性对驾驶行为影响研究[D].吉林大学,交通运输工程,2014,硕士.
[7]李本友.由近代上海看“海派教育”的特色及其形成[D].华东师范大学,中国教育史,2001,硕士.
[8]汪达.信用衍生产品价格波动影响因素分析[D].吉林大学,金融,2013,硕士.
[9]郑桂水.引滦隧洞安全评估系统研究[D].清华大学,水工结构工程,2002,硕士.
[10]李敏.网络信息资源的开发与服务[J].图书馆理论与实践,2003,04:32-34.
[11]齐学鸿.学大教育沈阳分公司员工激励机制问题研究[D].东北大学,工商管理,2009,硕士.
[12]田步宁.大肠早癌自体荧光内镜定位诊断系统研究[D].中南大学,外科学,2004,硕士.
[13]姜弢,林君.相控震源与组合震源地震信号检测结果对比[J].控制与决策,2004,12:1345-1348+1353.
[14]曲晶瑶.政府信息公开背景下的公民档案利用权利保障研究[D].黑龙江大学,档案学,2013,硕士.
[15]阙烁.改变节奏等分形式的音乐追求及相关乐感训练[D].天津音乐学院,音乐教育,2014,硕士.
[16]刘文娟.三部件贮备系统的可靠性分析[D].燕山大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[17]田慧然.特色古镇旅游环境友好度综合评价研究[D].华侨大学,人文地理学,2014,硕士.
[18]俞萍.货币供应量对通货膨胀效应的定量分析[D].复旦大学,世界经济,2012,硕士.
[19]罗治洪,段万春,唐立新.修改D-W分解求具有需求时间窗和投机性成本的批量问题[J].控制与决策,2012,10:1588-1592.
[20]章彦淋.论信访者的权利滥用及其法律规制[D].南京师范大学,宪法学与行政法学,2012,硕士.
[21]王晓翔.基于关联规则挖掘的仪表生产质量管理研究及系统设计[D].河北工业大学,2005.
[22]职亮亮.价值工程在B2C电子商务物流配送中的应用研究[D].北方工业大学,企业管理,2013,硕士.
[23]李光磊.QGP相变中粒子关联与强子化机制的研究[D].华中师范大学,理论物理,2014,硕士.
[24]翟鹏程.转体梁施工中的不平衡问题及风致振动研究[D].北京交通大学,2008.
[25]李乃聚,邓良元,吕功训,许云志,付强.GeoQuest系统输出图件汉化显示[J].石油地球物理勘探,1992,03:342.
[26]朱斐斐.对不成功语言学习者学习策略的认知研究[D].武汉理工大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[27]曾繁相.农村职业技术教育与农村经济的可持续发展[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[28]李海龙.家庭伦理电视剧对主流文化价值体系的构建[D].云南师范大学,广播电视艺术学,2013,硕士.
[29]马超飞.基于关联规则的遥感数据挖掘与应用[D].中国科学院研究生院（遥感应用研究所）,2002.
[30]温凤兰.CRM与数据挖掘技术[J].商场现代化,2002,07:12-14.
[31]龙黄珠.初中留守学生英语课堂消极沉默的现状及对策研究[D].湖南师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[32]魏坤.三相电压型可逆变流器的最优控制研究[D].燕山大学,控制理论与控制工程,2003,硕士.
[33]朱正觉.江苏省古柏镇方言代际差异考察[D].安徽大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[34]马改霞.我国上市商业银行市场风险的压力测试研究[D].山西财经大学,金融学,2013,硕士.
[35]顾梦婕.微种植钉周期性加力压低犬磨牙牙周组织中MMP-2表达的实验研究[D].吉林大学,口腔临床医学,2014,硕士.
[36]刘连江.垂直潜流人工湿地优化设计与运行研究[D].山东建筑大学,建筑与土木工程（专业学位）,2012,硕士.
[37]张钢.城市轨道交通能馈式牵引供电技术研究[J].电气时代,2014,03:48-50.
[38]刘刚.孕激素（DHP）在硬骨鱼类减数分裂启动过程中的作用机制研究[D].西南大学,动物学,2014,硕士.
[39]陈刚.美洲南瓜CCR基因与种皮发育和抗白粉病相关性研究及其功能分析[D].甘肃农业大学,植物病理学,2013,硕士.
[40]于勇,邢爱国,吴颖.可编程控制器使用注意事项[J].冶金自动化,1995,05:50-51.
[41]杜海军,柳斌,罗乐,李玉美,班睿,吕昱.拟除虫菊酯的电化学与生物传感器检测的研究进展[J].化学试剂,2015,05:415-419.
[42]王志远.村干部权力获得与合法化研究[D].河北大学,社会学,2014,硕士.
[43]高鸿.1948—2001年全球陆地降水场气候变化若干问题研究[D].南京气象学院,气象学,2004,硕士.
[44]林明正.基于B3模型的钢筋混凝土梁徐变研究[D].北京交通大学,结构工程,2013,硕士.
[45]张哲铭.TD-LTE-Advanced系统无线资源分配算法研究[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[46]崔平.LPV系统的鲁棒故障估计与主动容错控制[D].上海交通大学,2008.
[47]莫劲翔.汽车碰撞动力学响应分析及波形梁护栏防护性能的改进研究[D].湖南大学,机械电子工程,2003,硕士.
[48]周俊勇.无速度传感器定子磁链矢量控制系统研究[D].浙江工业大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[49]王旭颖.基于MIMO技术的可见光通信系统的研究[D].南京邮电大学,光学,2013,硕士.
[50]张振元.山东地区居住建筑种植屋面节能关键因素计算机辅助设计[D].山东大学,建筑设计及其理论,2012,硕士.