异氟醚吸入对小鼠场景恐惧记忆的抑制效应及与海马组蛋白乙酰化修饰的关系

【摘要】目的观察异氟醚吸入对于小鼠场景条件恐惧(contexualfearconditioning,CFC)记忆形成的抑制效应,同时观察小鼠场景条件恐惧训练后脑海马区组蛋白乙酰化以及记忆相关蛋白c-Fos、BDNF表达的变化,并初步阐释异氟醚吸入对记忆形成过程中海马组蛋白乙酰化的影响与其产生的遗忘效应之间的关系。方法1.72只8周龄雄性C57BL小鼠,随机分成6组(n=12),各组处理如下：Air+CFC组：小鼠予以30%富氧空气吸入30min后行CFC训练,24h后暴露原场景行CFC测试；0.2%ISO+CFC组：：小鼠予以30%02+0.2%异氟醚吸入30min后行CFC训练,24h后行CFC测试；0.4%ISO+CFC组：同上,只是异氟醚浓度为0.4%;0.6%ISO+CFC组：同上,只是异氟醚浓度为0.6%；Air+MT(mocktraining)组：小鼠予以30%富氧空气吸入30min后行模拟CFC训练(履行CFC实验训练阶段除足底电击外所有流程),24h后暴露原场景行凝滞行为测定；0.4%ISO+MT组：小鼠予以30%02+0.4%异氟醚混合气体吸入30min后行模拟CFC训练,24h后暴露原场景行凝滞行为测定。2.36只8周龄雄性C57BL小鼠,随机分成6组(n=6),各组处理如下述：Air+Naive组：小鼠提前4天于气体吸入箱中饲养,予以30%富氧空气吸入30min;ISO+Naive组：小鼠提前4天于气体吸入箱中饲养,予以30%02+0.4%异氟醚混合气体吸入30min;Air+MT组：小鼠原鼠笼饲养,予以30%富氧空气吸入30min后行模拟CFC训练(履行CFC实验训练阶段除足底电击外所有流程)；ISO+MT组：小鼠原鼠笼饲养,予以30%02+0.4%异氟醚混合气体吸入30min后行模拟CFC训练；Air+CFC组：小鼠原鼠笼饲养,予以30%富氧空气吸入30min后行CFC训练；ISO+CFC组：小鼠原鼠笼饲养,予以30%02+0.4%异氟醚混合气体吸入30min后行CFC训练。各组小鼠完成以上处理1h后断头处死取小鼠全脑。鼠脑显微分离海马CA1、CA2/3和DG区组织行western-blot法测定乙酰化H3K、H3K14、H4K5、H4K12及c-Fos、BDNF蛋白水平。3.104只8周龄雄性C57BL小鼠,随机分成四组(n=26),各组处理如下:NS+Air组：小鼠先予以慢性27天生理盐水腹腔对照注射,吸入含30%O2的富氧空气30min后进行CFC训练；SB+Air组：小鼠先予以慢性27天SB(sodiumbutyrate,丁酸钠)溶液腹腔注射,予以吸入含30%O2的富氧空气30min后进行CFC训练;NS+ISO组：小鼠先予以慢性27天生理盐水腹腔对照注射,吸入30%O2+0.4%异氟醚混合气体30min后进行CFC训练；SB+ISO组：小鼠先予以慢性27天SB溶液腹腔注射,吸入30%O2+0.4%异氟醚混合气体30min后进行CFC训练；各组小鼠训练1h后断颈处死小鼠,取全脑固定行海马组蛋白乙酰化、c-Fos免疫组化分析(n=6),及显微分离海马CA1区行组蛋白乙酰化、c-Fos、BDNF的Western-Blot分析和c-Fos、BDNFmRNA的RT-PCR分析(n=6),各组余14只小鼠回原鼠笼过夜并予以最后一次腹腔注射,第二天行CFC测试。结果1.在CFC训练中,给予1.0mA足底电击2s后,Air+CFC组小鼠均出现惊叫、跳跃、逃避等恐惧/防御反应；0.2%ISO+CFC和0.4%ISO+CFC组与Air+CFC组比较差异无统计学意义,而0.6%ISO+CFC组跳跃、逃避反应发生率均降低；Air+CFC组、0.2%ISO+CFC组和0.4%ISO+CFC组小鼠CFC测试阶段凝滞时间百分比与训练阶段比较均上升,0.6%ISO+CFC组则相反；在CFC训练阶段,0.2%ISO+CFCf口0.4%ISO+CFC组凝滞时间百分比与Air+CFC组比较差异无统计学意义,而0.6%ISO+CFC组则上升；在CFC测试阶段凝滞时间百分比的比较中,Air+CFC组>0.2%ISO+CFC组>0.4%ISO+CFC组>0.6%ISO+CFC组。2.Western-blot结果显示,与air+naive组比较,air+MT组海马CA1区乙酰化H3K9、H3K14、H4K12水平及c-Fos表达上升,air+CFC组海马CA1区乙酰化H3K9、H3K14、H4K5、H4K12水平及c-Fos、BDNF表达均上升,ISO+naive组海马组蛋白乙酰化与c-Fos、BDNF表达差异均无统计学意义；与air+MT组比较,ISO+MT组海马组蛋白乙酰化水平与c-Fos、BDNF表达差异均无统计学意义；与air+CFC组比较,ISO+CFC组海马CA1区乙酰化H3K14、H4K5、H4K12水平及c-Fos、BDNF表达均降低。3.Western-blot分析、免疫组化分析均显示NS+ISO组小鼠海马CA1区H3K14、H4K5.H4K12乙酰化水平在CFC训练1h时较NS+Air组降低,而SB+ISO组以上指标较NS+ISO组升高；Western-blot分析、免疫组化分析、RT-PCR分析均显示NS+ISO组小鼠海马CA1区c-Fos表达在CFC训练1h时较NS+Air组降低,而SB+ISO组c-Fos表达较NS+ISO组升高；Western-blot分析、RT-PCR分析均显示NS+ISO组小鼠海马CA1区BDNF表达在CFC训练1h时较NS+Air组降低,而SB+ISO组BDNF表达较NS+ISO组升高；另外,NS+ISO组小鼠在CFC测试时的凝滞时间百分比较NS+Air组降低,而SB+ISO组凝滞时间较NS+ISO组升高。结论1.低浓度的异氟醚吸入可以产生遗忘效应,而其中0.4%的异氟醚吸入30min可以有效抑制CFC记忆的形成,而且对小鼠正常行为能力及对疼痛刺激的感受反应无明显影响,适用于小鼠遗忘模型的建立。2.CFC记忆的形成与海马H3K9、H3K14、H4K5和H4K12组蛋白乙酰化及其介导的记忆相关蛋白c-FOS和BDNF表达改变有关,而0.4%的异氟醚吸入可以抑制CFC训练诱发的H3K14、H4K5和H4K12组蛋白乙酰化及下游c-FOS和BDNF的表达。3.慢性腹腔注射SB可以拮抗0.4%异氟醚吸入对于CFC记忆形成的抑制效应,其机制可能与其拮抗0.4%异氟醚吸入诱发的CFC训练后]H3K14、H4K5和H4K12组蛋白乙酰化及其调节的c-Fos、BDNF基因表达的抑制效应有关。
【作者】钟涛；
【导师】郭曲练；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】异氟醚；遗忘；场景条件恐惧记忆；海马；组蛋白乙酰化；丁酸钠；

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