基于大豆种子油体系统表达重组白介素IL-21的研究

【摘要】种子作为植物重要储藏器官之一，为高效表达外源重组药物蛋白提供了理想的载体。与其他植物生产系统相比，植物种子反应器具有多方面的优势，包括表达水平较高，重组蛋白活性稳定，易于储藏和运输以及便于加工，分离和纯化等。在过去的二十年中，利用植物种子作为反应器表达了一系列重组药物蛋白，部分药物蛋白甚至已进入商业化生产阶段。植物细胞中合成的蛋白一般存在于细胞质或是通过分泌途径定位到各类细胞器或是质外体。重组蛋白在细胞中的定位表达不仅影响其表达水平和稳定积累，同时也深刻影响重组蛋白的翻译后修饰（组装与折叠、二硫键的形成、多亚基组装等）及其生物学功能。油体是植物种子中贮存油脂的亚细胞器，其周围覆盖了一层高密度的低分子量（15-26kDa）疏水油体蛋白。通过与油体蛋白的融合表达，不仅可以实现重组蛋白油体表面的靶向定位和稳定表达，同时为后期重组蛋白分离纯化提供了十分便利的条件。利用油体系统表达重组蛋白已成为目前植物生物反应器研究领域的重要内容之一。本研究基于大豆种子高蛋白（～40%）和高油脂（～20%）含量的特点，采用油体蛋白分子介导方法，通过大豆24kD油体蛋白Oleosin与白介素IL-21的融合，实现重组融合蛋白在转基因大豆种子油体中的高效和稳定表达，从而为重组药物蛋白IL21及其他高附加值重组蛋白的规模化、低成本生产提供一个高效的生产平台，同时也为进一步拓展大豆产品功能形态，大幅度增加大豆产品附加值提供一个新的技术思路。本研究主要获得如下实验结果：1.根据豆科植物偏爱性密码子，对白介素IL21基因序列（489bp）进行人工优化合成。采用常规分子操作手段，将IL21基因构建到植物表达载体pCAMBIA3300-bscp-Oleosin-gfp载体中，替换载体中的gfp基因序列，构建表达载体pCAMBIA3300-bscp-Oleosin-IL21；2.在已建立的大豆子叶节转化技术体系的基础上，通过农杆菌介导转化方法，将Oleosin-IL21基因导入到大豆植物基因组中，共获得PCR阳性转基因大豆植株30株。转基因植株在表型上与对照受体大豆品种SN9没有明显差异；3.Southernblot杂交检测结果表明外源基因IL-21已整合到大豆基因组中。对T1代转基因大豆植株进行PCR跟踪检测结果表明，目的基因已获得稳定遗传。4.采用RT-PCR、Western杂交等方法，初步确定外源基因在转基因植株中获得表达。下一步将通过ELISA技术分析外源重组蛋白Oleosin-IL21的表达水平和稳定性。在此基础上，利用油体亲脂疏水的特性及蛋白酶的特异性切割（凝血酶），从大豆种子中分离和纯化IL21重组蛋白，并开展相应的生物学功能研究。
【作者】蒋滢；
【导师】马莲菊；杨向东；
【作者基本信息】沈阳师范大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】植物生物反应器；IL-21；油体表达系统；大豆；

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