苜蓿和大豆高效表达蛋白质相关特异性启动子的克隆与功能研究

【摘要】转基因植物能作为一种廉价、方便、安全的生物反应器大量生产重组蛋白。在过去的十几年,科学家们利用植物生物反应器生产了100多种重组蛋白,包括：可食用疫苗、抗体和工业酶等；有些产品已经实现了商业化生产,并且创造了良好的经济价值。然而,一些因素诸如产量、品质和同源性等限制了植物生物反应器的广泛应用。增加抗原基因在转基因植株中的表达量是研制安全高效的植物可食用疫苗的关键,而解决的策略集中在启动子的研究。为此本研究选用大豆和苜蓿作为受体植物,在光照和黑暗2种条件下培养,经SDS-PAGE和2D-PAGE分离得到二种苜蓿光照条件高效表达的蛋白质(AL-a和AL-b)和一种大豆黑暗条件高效表达的蛋白质(SN-p)；委托日本BIOSUMS公司进一步测定了AL-a的N-末端7个氨基酸VEVLLGA(Val-Glu-Val-Leu-Leu-Gly-Ala),并在NCBI数据库中比对查找得到一个最相似的蛋白质-豌豆质体蓝素(plastocyaninofpea,AccessionNo.X16082),命名AL-a为苜蓿质体蓝素(alfalfa-plastocyanin,AP);根据豌豆质体蓝素基因序列设计引物,从苜蓿中PCR扩增苜蓿质体蓝素基因,产物经AppliedBiosystems3130GeneticAnalyzers自动测序仪测定其DNA序列,对测定结果进行分析显示苜蓿质体蓝素基因包括504bp,并由此DNA序列推出苜蓿质体蓝素的氨基酸序列包括167AA,通过ChloroP软件分析预测此蛋白为叶绿体定位表达(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)。此序列与豌豆质体蓝素基因比对同源性为90%。本研究拟利用植物自身高效表达的特殊蛋白质基因的启动子驱动外源蛋白基因在植物体内同源重组并定点高效表达,从而提高蛋白表达量。植物蛋白质的表达特性直接决定于其启动子的类型。本实验利用RT-PCR法分析苜蓿质体蓝素基因的表达特性,结果表明此蛋白基因启动子既具有组织特异性(只在绿色组织-嫩叶中表达)又具有光诱导特异性(只在光照条件下表达)。根据NCBI数据库中报道的蒺藜苜蓿(Medicago.truncatula)(GenBank:CU013531.5)全基因组序列中质体蓝素编码基因区上游非编码区序列设计引物,以本实验室保存的苜蓿总DNA为模板PCR克隆苜蓿质体蓝素基因启动子序列,经测序后得到含有约400bp的序列(其中包括131bp的编码区和269bp的启动子区P-AP)；应用PlantCARE软件将本实验获得的苜蓿质体蓝素启动子序列与文献报道的豌豆质体蓝素启动子序列(P.sativumpetEgene,GenBank:X68313.1)进行比对分析,发现该序列具有启动子核心元件TATA-box、CAAT-box;除此之外,该启动子还包含多个光应答调控元件和叶片特异性元件包括LAMP-element、G-box、Pc-CMA2a、Pc-CMA2b、Pc-CMA2c和GT1-motif等。初步判定此序列为苜蓿质体蓝素基因启动子部分片段。为了研究此序列的表达活性,本试验将此序列置换pBI121质粒中的CaMV35S启动子,驱动其下游的GUS[P-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)]基因,构建了重组质粒pBI121-P-AP,转化根癌农杆菌(AgrobacteriumtumefaciensEHA105)后建立植物转化载体,经农杆菌浸种法转染苜蓿,转基因苜蓿经PCR法检测及组织化学检测GUS基因表达,结果显示GUS基因在绿色叶片组织中呈高效表达,在茎组织中基本不表达,初步研究证明启动子的组织特异性表达功能。为利用此启动子驱动人类表皮生长因子受体HER-2基因在转基因苜蓿中高效特异表达生产植物可食抗癌疫苗奠定了基础。
【作者】苏昕；
【导师】游松；
【作者基本信息】沈阳药科大学，微生物与生化药学，2011，博士
【关键词】苜蓿；大豆；高效表达；质体蓝素；特异性启动子；转基因苜蓿；

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