转基因产品快速检测技术的研究

【摘要】随着转基因技术的快速发展，转基因作物的种类和数量也急剧增加。由于越来越多的外源插入元件被转入的作物中，直接检测某种插入元件或特异性转化事件变得费时、费力并且成本较高。所以国外许多转基因产品检测机构逐步建立转基因产品的快速筛选技术，并与矩阵方法相结合大大提高了转基因产品的检测效率，这种快速筛选技术在我国还没有相关的报道。由于不同国家对转基因产品的管理存在差异，所以这种快速筛选检测技术的方法以及所选用的筛选元件也不尽相同。本研究依据我国进出口转基因产品的外源基因、调控元件、标记基因和T-DNA通用序列信息建立了适合国内的转基因产品快速检测的方法。主要研究如下：1、pCaMV35S和tNOS在转基因生物及其制品检测中的适用性研究：pCaMV35S和tNOS是转基因产品筛选检测中的首选参数，日常检测中发现，个别标准中的引物存在非特异性扩增和灵敏度差的问题。本实验收集了国内外标准中常用的扩增片段分别为195bp、165bp、147bp、123bp的pCaMV35S和扩增片段分别为180bp、172bp、165bp、118bp的tNOS各四对引物，应用普通PCR和实时荧光（Real-time）PCR方法，对8对引物的特异性、灵敏度及在加工品中的扩增性进行了测试和适用性评价。经过测试pCaMV35S165bp和147bp、tNOS172bp和165bp具有很好的特异性，灵敏度高，在不同的加工品中也表现出很强的检测能力，筛选检测效果最佳。pCaMV35S195bp和tNOS180bp扩增实验中扩增微弱，经常出现非特异性扩增。pCaMV35S123bp和tNOS118bp较其它引物相比扩增弱且扩增不稳定。所以本研究通过普通PCR和实时荧光（Real-time）PCR的结合对不同国标中出现的引物进行适用性评价，为转基因产品的检测监管提供可靠技术依据。2、基于SYBRGreenI同时检测转基因产品16种元件的快速检测技术的研究：本实验通过收集转基因产品的外源基因、调控元件、标记基因和T-DNA通用序列信息，重点考虑退火温度和扩增片段长度，设计或收集适合于一次性扩增的PCR引物SPS、PLD、Lectin、HMGI/Y、Zein、pCaMV35s、FMV35S、T-35S、E93’、g7、tNOS、Gus、Cry1Ab、cry2Ab、NptⅡ、PAT、Cry2Ab、g7、E9、barnase、barstar21组，实验中用实时荧光（Real-time）PCR方法，对21组引物的特异性、灵敏度进行了测试，结合扩增曲线、溶解曲线、Ct值以及引物正常扩增的Tm值，筛选出特异性好、灵敏度高符合转基因产品快速检测的引物。在特异性扩增实验中，SPS、PLD、Lectin、HMGI/Y、Zein、pCaMV35s、FMV35S、T-35S、E93’、g7、tNOS、Gus、Cry1Ab、cry2Ab、NptⅡ、PAT都成功得到扩增，溶解曲线均为单峰溶解曲线，空白对照没有产生相应的特异性扩增，而barnase、barstar引物出现非常微弱的扩增，这些微弱的扩增信号可能是由于实验样品中该外源基因成分含量较低的原因。所以21组引物都具有很强的特异性。为了测定每组引物的灵敏度，所选用的植物实验材料均为1%的转基因阳性材料，在经过浓度梯度稀释，稀释后的转基因含量均小于0.01%。通过测试，21组引物中除cry2Ab、PAT的灵敏度为0.1%外，其余引物的检测灵敏度均为0.01%。计算每种引物所能检测的最低拷贝数，除cry2Ab最低可检测42个拷贝，PAT最低可检测85个拷贝外，其余引物均能检测到低于10个拷贝。通过实验可以看出，每种引物在正常扩增是均有固定的Tm值（误差在1℃内），这就为检测转基因含量较低的样品提供了可靠的依据。3、基于转录组测序对转基因水稻中Bt基因和其他非预期基因表达的研究：本文对W1201克螟稻、W1202秀水11、W1207眀恢86、W1208TT51、W1209明恢63、W1109科丰6进行转录组测序，比较并分析转基因水稻与其受体材料的基因表达差异，筛选出了预期表达基因Bt和转基因水稻中的非预期表达基因。Bt基因在转基因水稻中均得到表达，尤其在W1109科丰6中Bt基因表达量明显高于W1201克螟稻和W1208TT51，而在非转基因水稻中没有出现任何表达，这从表达谱测序水平上支持了Bt基因检测的结果。通过对差异表达基因进行GO（GeneOntology）功能和KEGGPathway分析，这些差异表达基因按其功能主要归为生物学过程（Biologicalprocess）、细胞组分（Cellularcomponent）、分子功能(Molecularfunction)三类；按代谢通路主要归为新陈代谢（Metabolism），基因信息处理（GeneticInformationProcessing），细胞过程(CellularProcesses)三种代谢途径。通过对差异表达基因的GO（GeneOntology）功能和KEGGPathway显著性富集分析，最终确定三种转基因水稻在不同生物学功能和代谢途径的表达差异。为进一步推测这些非预期差异表达基因的表达性状和效应提供重要的依据。
【作者】王鹏飞；
【导师】李玥莹；徐俊锋；
【作者基本信息】沈阳师范大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】转基因检测；特异性扩增；灵敏度；实施荧光；PCR；EST；

【参考文献】
[1]彭蕊,辛晶,康开斌,赵敏,王强,许主国.光限幅材料研究进展[J].兰州大学学报(自然科学版),2013,06:854-860.
[2]赵克友,郭磊.不变根分布的多项式的最大摄动界[J].自动化学报,1995,04:385-391.
[3]王明.基于非参数可加模型的房价影响因素分析[D].浙江工商大学,数量经济学,2012,硕士.
[4]孙立超.深基坑围护结构变形的广义神经网络研究[D].中国地质大学（北京）,地下建筑工程,2014,硕士.
[5]中国人民银行河南邓州市支行宋玉长李本勇王明华.数据仓库技术在银行的应用和发展（上）[N].网络世界,2002-01-14038.
[6]谢珍.工作价值观对关联绩效影响的实证研究[D].南京师范大学,企业管理,2012,硕士.
[7]黄子璇.特高压输电线路电磁环境预测计算的研究[D].郑州大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[8]彭闯.山西省中小学学校体育均衡发展评价指标体系构建研究[D].山西师范大学,体育教育训练学,2014,硕士.
[9]关亚军,马忠权.核心力量的定义及作用机制探讨[J].北京体育大学学报,2010,01:106-108.
[10]李妍.公用企业成本考核指标体系构建研究[D].沈阳理工大学,会计,2013,硕士.
[11]杨敬安.关于融合多针图确定物体三维表面绝对深度的研究[J].自动化学报,1996,01:58-67.
[12]王健.保险人说明义务研究[D].西北大学,法学（专业学位）,2014,硕士.
[13]陈皓伦.老年男性冠心病患者血清睾酮水平的临床研究[D].延安大学,内科学,2014,硕士.
[14]王新彩.我国土地财政与地方政府行为研究[D].吉林大学,财政学,2013,硕士.
[15]李伟庆.沁水县城镇企业职工养老保险问题研究[D].山西财经大学,社会保障,2014,硕士.
[16]邹远强.山西省青少年科学健身素养状况与教育策略研究[D].山西师范大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[17]霍梅梅.心室电学—力学复合模型初步建模仿真研究[D].浙江大学,2003.
[18]方淼.苯马树脂及其改性物的合成与颜料分散性能研究[D].湖北工业大学,化学工艺,2014,硕士.
[19]李树斌.高温高压热水循环泵密封冷却系统综述[J].通用机械,2014,09:90-92.
[20]田慧.九三学社长春市委员会基层组织参政议政问题研究[D].东北师范大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[21]郭建媛,贾利民,秦勇.运行计划约束下的动态可达性分析与计算[J].交通运输系统工程与信息,2015,01:118-122.
[22]姜秀亚.人民币汇率市场化问题研究[D].首都师范大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[23]侯宇.金正恩执政后的美朝关系[D].外交学院,英语语言文学,2014,硕士.
[24]徐本臣.FTY720治疗大鼠急性脊髓损伤对脂质过氧化反应的影响[D].大连医科大学,外科学,2012,硕士.
[25]骆孟波.汽车故障逻辑诊断方法的应用研究[D].河北科技大学,机械工程,2013,硕士.
[26]魏天伟.基于LLC串联谐振的高效率LED驱动器研究与设计[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[27]李静.粘性土弱透水层孔隙水地球化学特征及其环境指示[D].中国地质大学,地下水科学与工程,2014,博士.
[28]尹春英,彭幼红,罗建勋,李春阳.杨属遗传多样性研究进展[J].植物生态学报,2004,05:711-722.
[29]郭慧霞.定向γ辐射仪的研制[D].中国地质大学（北京）,电子与通信工程,2013,硕士.
[30]郑志琴.基于D-InSAR技术的矿区地表沉陷监测及其数据处理研究[D].西安科技大学,大地测量学与测量工程,2014,硕士.
[31]李艳君.我国缺陷食品侵权救济制度研究[D].华东交通大学,民商法学,2013,硕士.
[32]唐耀华,张向君,高静怀.基于地震属性优选与支持向量机的油气预测方法[J].石油地球物理勘探,2009,01:75-80+130+3+2.
[33]石颖.我国上市公司内部控制评价指标体系研究[D].首都经济贸易大学,会计学,2014,硕士.
[34]王卓亚.含重金属废水处理站污泥资源化研究[D].兰州大学,环境工程,2013,硕士.
[35]李臣.网络游戏中的虚拟物品交易行为研究[D].兰州大学,社会学,2013,硕士.
[36]姜艳娇.大庆长恒南部浅层稠油储层测井评价方法研究[D].东北石油大学,地球探测与信息技术,2013,硕士.
[37]刘向阳.丝素蛋白硬脑膜修复材料的生物相容性研究[D].苏州大学,神经外科学,2003,硕士.
[38]段飞翔.阳城县古戏台调查与研究[D].山西师范大学,戏剧戏曲学,2014,硕士.
[39]王笑一.冯法祀油画艺术研究[D].渤海大学,美术学,2013,硕士.
[40]解菊,陈雪松,黄志凌.石墨烯片层模型吸附二噁英的计算机模拟研究[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第18分会：超分子组装与软物质材料[C].中国化学会:,2014:1.
[41]刘松贺.大卫·体谟的正义思想研究[D].黑龙江大学,政治学理论,2013,硕士.
[42]韩慧芳.“家”文化管理模式理论与实证研究[D].郑州大学,企业管理,2013,硕士.
[43]涂智萌.滚珠丝杠副可动结合部的有限元法动力学建模[D].华中科技大学,机械电子工程,2013,硕士.
[44]陆大雄.光阳钢铁厂的CIM系统[J].冶金自动化,1994,02:40-45.
[45]谭杰.水处理自动化系统的研究与设计[D].武汉理工大学,控制工程,2003,硕士.
[46]龚梁蓉.大陆、台湾、香港高考语文试题比较研究[D].湖南师范大学,教育,2003,硕士.
[47]褚进华.基于GIS的耕地地力评价与触摸屏查询系统研究[D].安徽农业大学,土壤学,2011,硕士.
[48]尚萌.污水源热泵换热器污垢生长规律及对机组性能影响[D].西安建筑科技大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2013,硕士.
[49]高佳冰.静态与动态水热法制备钛酸钡纳米晶及其掺杂改性研究[D].郑州大学,材料工程,2013,硕士.
[50]成艳英.本煤层钻孔瓦斯抽采失效机制及高效密封技术研究[D].中国矿业大学,安全技术及工程,2014,硕士.