亮菌口服液液体深层发酵工艺的研究

【摘要】亮菌学名假蜜环菌[Armillariellatabescens(Scop.exFr.)Sing],是一种大型的药食兼用型真菌。因菌丝体在暗处发出蓝色的荧光,故称之为亮菌。根据相关文献,该菌对于肝炎、胆囊炎、肿瘤以及放化疗引起的白细胞减少等炎症有一定的疗效,且还具有利肺、醒酒、益肠胃、强筋壮骨、疏风活络等保健功效。亮菌口服液是一款利用现代生物制药工艺将亮菌经培养发酵提取后制得的药品,内含有亮菌甲素、亮菌多糖以及氨基酸、多肽等多种生物活性物质。目前国内亮菌口服液及胶囊等相关制剂多采用固体发酵的生产工艺。以玉米粉、红薯粉等为原料按一定比例混合制得固体培养基,灭菌接种,然后恒温避光培养两个月左右。此生产工艺优点是发酵程度深,利于多种药用有效成分的表达和积累；缺点是生产周期长,污染的概率大,且一旦染菌则只能全部作废,造成极大浪费,且发酵终了培养基中残糖浓度依然很高,既影响产品的下游提取工作也造成了原料的浪费。因此,固体发酵规模小、周期长、产能低的缺点严重制约了企业的产能和效益。合肥诚志生物制药有限公司在亮菌口服液的生产过程中发现随着亮菌传代次数的增加,菌种逐渐退化减产,降低了企业的产能和及药品的效价。本实验室希望能够找到一种延缓亮菌退化或使其复壮的简单易行的方法和技术。针对合肥诚志生物制药有限公司提供的生产工艺和亮菌菌种,本实验室已开展了一系列研究。具体如下：(1)亮菌液体种子制备及其应用研究；(2)亮菌液体发酵初步研究；(3)亮菌固体发酵多糖提取工艺的优化；(4)现行工艺亮菌固体发酵条件改良。在前期工作的基础上,本文对亮菌液体种子深层发酵和静置发酵两种发酵工艺进行初步研究,探究其取代传统的亮菌固体发酵方式的可行性,为亮菌口服液的液体种子发酵生产工艺技术提供参考；以及对亮菌菌种复壮方法进行初步的研究。本论文主要内容：(1)亮菌液体种子深层发酵工艺的探究；(2)亮菌液体种子静置发酵工艺的探究；(3)发酵液组分的剖析；(4)退化亮菌菌种复壮的初步研究。研究结果为：(1)亮菌液体种子深层发酵工艺的研究结果：通过14L小型发酵罐液体深层发酵对亮菌液态种子发酵工艺进行优化探究。采用28℃,通气量为1:1v/v·m,200r/min,培养一周,得亮菌干重16.55g/L,其中菌丝体中亮菌多糖含量为5.42%,蛋白含量为1.75%。结果表明,通过发酵罐液体种子深层发酵方式所获得的亮菌生物量高,且周期短,但缺点是发酵程度低,发酵液颜色不深,无法像固体发酵那样产生菌丝体分泌大量棕褐色液体的现象。(2)亮菌液体种子静置发酵工艺的研究结果：液体静置发酵采用500ml三角瓶,28℃,150r/min,摇瓶3天后静置发酵14天,亮菌干重为10.69g/L,发酵液中亮菌多糖含量为1.016g/L,蛋白含量为0.320g/L。观察发现每一个三角瓶都能分泌大量棕褐色胞外液且形成粗壮多分支的菌索,相对于传统的固体发酵,这大大缩短了发酵周期,且发酵液质量高,杂质少,提取浓缩简单易行,亮菌多糖等活性成分指标均优于传统的固体发酵。(3)发酵液组分的分析研究结果：虽然静置发酵得到的亮菌生物量不及发酵罐液体深层发酵,但后者的发酵程度深,能够产生菌丝体分泌大量棕褐色胞外液的现象,培养基利用率高,优于传统的固体发酵。对液体静置发酵工艺进一步研究发现其发酵液中亮菌甲素含量可达3.118mg/L。(4)亮菌菌种复壮的初步研究结果：通过在普通的培养亮菌的PDA固体培养基中分别添加不同浓度柳木屑提取液、稻草提取液和不同种类的微量元素,探索其对亮菌菌种的复壮效果高低,初步研究发现亮菌在添加了稻草提取液的PDA固体培养基上生长旺盛,复壮效果明显。进一步研究发现添加1%浓度稻草提取液对亮菌复壮效果最明显。静置发酵法不仅在发酵成本方面优于发酵罐液体深层发酵法,而且静置发酵法操作简便,可以取代传统的固态发酵工艺；以及在PDA固体培养基中添加稻草提取液对亮菌菌种进行复壮的研究,为合肥诚志生物制药有限公司生产亮菌口服液相关工艺的优化和改进提供参考,具有一定的实践和应用价值。
【作者】徐来清；
【导师】张书祥；
【作者基本信息】安徽大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】亮菌；发酵罐；深层发酵；静置发酵；复壮；

【参考文献】
[1]陆政德.CD4+LAP+T细胞在慢性心力衰竭患者中的变化及意义[D].广西医科大学,心血管内科（专业学位）,2013,硕士.
[2]张志阳.防屈曲支撑框架结构的设计与分析[J].城市轨道交通研究.2007(07)
[3]何委玲.视觉文化背景下的油画创作研究[D].广西师范大学,美术学,2013,硕士.
[4]张仁任.电子元器件塑料封装问题的讨论[J].电子元件与材料.1983(01)
[5]夏晶晶.负荷组合预测与电煤存储第三方物流的研究[D].华中科技大学,系统工程,2013,硕士.
[6]任小玉.岩生植物金发草生长特征及其环境适应性的初步研究[D].西南农业大学,环境工程,2004,硕士.
[7]朱腾.基于可信计数器的拜占庭容错技术研究[D].华中师范大学,计算机技术,2014,硕士.
[8]辛毅,程勉,高为炳.加前馈补偿的工业机器人自适应控制[J].自动化学报,1989,04:383-384.
[9]陶鹏.资源分享对地方院校人才培养的影响与对策[J].成人教育,2013,11:57-59.
[10]刘宁海.基于双目视觉的立体匹配算法研究[D].浙江理工大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[11]王晨.全面抗战前（1912-1937）河北外来物种引进分析[D].河北师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[12]钟芳.中国锹甲科部分属种鞘翅和雄性外生殖器外翻囊的超微形态研究（鞘翅目：金龟总科）[D].安徽大学,生态学,2013,硕士.
[13]李宇.分布式空时编码OFDM系统的性能研究[D].河南科技大学,检测技术与自动化装置,2014,硕士.
[14]张世涛1,2,朱建军1,刘小弟1,2.基于重要度引导偏好识别修正的多粒度语言共识模型[J].控制与决策.
[15]谢德晓,韩笑冬,黄鹤,王执铨.具有时延和丢包的网络控制系统H_∞状态反馈控制[J].控制与决策,2009,04:587-592+597.
[16]寇锐.论中国共产党对执政规律的探索及其历史经验[D].沈阳理工大学,马克思主义中国化研究,2012,硕士.
[17]刘国君.基于Struts2的鞍山电信设备管理系统的设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[18]闫一剑.迟钝爱德华氏菌平衡致死系统的构建及其在新型疫苗开发中的应用[D].华东理工大学,生物化工,2013,硕士.
[19]聂先玲.基于遗传算法优化的约束背景双线性分解算法用于改进高效液相色谱方法灰色分析体系校正准确度的研究[D].山西师范大学,药物分析,2014,硕士.
[20]雷晓敏.网络在线考试系统的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机技术,2010,硕士.
[21]孙薇.纳米氢氧化镍（钴）电极材料的制备及其电化学性能研究[D].哈尔滨工程大学,2012.
[22]刘虹.利益冲突视域下社会心理失衡问题研究[D].中共中央党校,思想政治教育,2013,硕士.
[23]陈旭东,陈仲新,赵雨兴.鄂尔多斯高原生态过渡带的判定及生物群区特征[J].植物生态学报,1998,04:25-31.
[24]李文津,汤广福,贺之渊.DFIG风电场经模块化多电平柔性直流并网控制策略[J].电力系统自动化,2013,15:20-26.
[25]刘岩.基于改进BP神经网络算法的唇读算法的研究与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[26]卫青青.中华鲟保护的地方立法研究[D].复旦大学,法律,2012,硕士.
[27]黄强.对马革顺与严良堃合唱指挥艺术风格的比较研究[D].曲阜师范大学,音乐学,2013,硕士.
[28]邵千顺.利用3个陆地棉群体定位纤维品质QTL[D].西南大学,作物遗传育种,2013,硕士.
[29]杨晓利.狄金森与玄学派诗歌[D].西南大学,英语语言文学,2014,硕士.
[30]刘元元.酸性硅胶材料的制备及其在[BMIM]Cl中催化纤维素水解反应的应用研究[D].天津大学,化学工艺,2013,硕士.
[31]李璠.超声评价正常中晚孕胎儿腔静脉形态和血流变化及其与胎儿右心功能的相关性研究[D].第四军医大学,影像医学与核医学（专业学位）,2014,硕士.
[32]黄志新.内皮祖细胞与脑动脉粥样硬化相关性及脂联素提高内皮祖细胞活性的机制研究[D].南方医科大学,神经病学,2014,博士.
[33]于华.西欧文艺复兴时期修女院的新变化探析[D].辽宁大学,世界史,2012,硕士.
[34]王学飞.基于多媒体网络的协同工作系统设计与实现[D].浙江大学,计算机应用,2004,硕士.
[35]甘士艳.《国王的人马》中的政治伦理[D].华中师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[36]许旸,谷加存,董雪云,刘颖,王政权.海南岛4个热带阔叶树种前5级细根的形态、解剖结构和组织碳氮含量[J].植物生态学报,2011,09:955-964.
[37]曹宇男,张勤俭,蔡永林,鄂明成,李建勇.CAD/CAM多元化教学模式探索与实践[J].江西理工大学学报,2015,02:69-72.
[38]李晶.基于导电聚合物功能化的Ni-Fe合金纳米阳极催化剂制备及应用研究[D].兰州大学,2014.
[39]曲爱妮.基于TAM和IDT模型的手机应用商城用户行为研究[D].北京邮电大学,企业管理,2013,硕士.
[40]鲁珍.我国传媒业上市公司多元化经营与绩效的关系研究[D].宁波大学,企业管理（专业学位）,2014,硕士.
[41]王梅蓉.葡多酚对长跑运动员血液流变学的影响[D].青岛大学,营养与食品卫生学,2003,硕士.
[42]陈琳荣.基于瞬态流场仿真技术的捻接过程分析及实验验证[D].浙江理工大学,机械电子工程,2014,硕士.
[43]万婷.基于双目视觉的运动物体三维轨迹重建研究[D].西南大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[44]闫剑虹,张治华.利用MATRIXx仿真软件辅助设计天线伺服系统[J].空间电子技术.1998(04)
[45]荆华.用影像法研究Eu 6p_(1/2)8s自电离态的自电离分支比[D].天津理工大学,光学,2013,硕士.
[46]刘心元.N-全（多）氟苯基芳香亚胺的化学转化及N-全（多）氟苯基吡咯和N-氟烷基磺酰基吡咯的合成[D].安徽师范大学,有机化学,2004,硕士.
[47]MOHAMMADReza-Davoodi,HAMIDReza-Momeni,ABDOLKARIMDaryabor.减少离散大系统两级镇定控制的保守性(英文)[J].自动化学报,2010,02:322-327.
[48]朱利萍.社区管理模式创新[D].苏州大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[49]王卫东.黑龙江省农民工培训问题研究[D].吉林大学,农业推广,2012,硕士.
[50]孙坚.复合电磁材料的Casimir效应[D].苏州大学,2014.