黑腹果蝇SCOT蛋白的结构研究

【摘要】琥珀酰辅酶A：3-羰基酸辅酶A转移酶(SCOT;EC2.8.3.5)在酮体代谢过程中发挥作用,是这一过程的限速酶。截至目前,大量的研究表明SCOT在哺乳动物中存在于细胞的线粒体中,在线粒体内发挥催化作用。酮酸中毒是病理性的,体内酮体的浓度可以作为检测是否是酮酸中毒的标志。酮酸中毒的情况下,人体无法足够地控制酮类的产生,体内酮体过多无法得到利用堆积在体内导致血液的pH极大地下降,严重时可致使人昏迷甚至导致死亡。包括人类、猪心脏、羊的肾脏、鼠脑中的CoA转移酶已得到了研究,转移酶发生作用的机制是乒乓机制。我们对模式生物黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)体内的琥珀酰CoA转移酶进行了研究。我们首先对黑腹果蝇中该蛋白进行了二级结构预测,通过预测结果截掉了该蛋白氮端的33个氨基酸,这些氨基酸在二级结构上表现为无规则卷曲的结构,不利于晶体的生长；因此我们构建了pET28a-his-TEV-CG1140(34-516aa)的重组质粒,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)菌株表达蛋白,通过亲和层析及凝胶排阻层析纯化了黑腹果蝇中的SCOT(DmSCOT)蛋白,利用气象扩散坐滴法得到了该蛋白的晶体,经过X-ray衍射数据收集和数据处理后解析了该蛋白的晶体结构。我们获得的DmSCOT蛋白的晶体分辨率是2.64A,空间族群属于P212121,单位晶包的参数是a=76.638,b=101.921,c=122.457,α=β=γ=90°。DmSCOT拥有典型的SCOT蛋白的三级结构,即采用了开放的α/β折叠。DmSCOT的单体由N末端(1-247aa)和C末端(259-484aa)结构域组成,每个结构域都含有α/β/α模式,结构的中间部分是7条β折叠片。二聚体的分子表面涉及了两个单体分子的63个氨基酸残基,生物学相关的DmSCOT的二聚体表面有疏水相互作用和一些p折叠片间形成的氢键。共有十二个氢键参与相互作用,包括单体上的氨基酸残基如下：Glu104,Arg107,Gly110,Ala111,Lys186,Arg189,Asp218,His221,Arg353andHis356;很多疏水作用和一些盐键也参与稳定了二聚化表面。DmSCOT第307位的谷氨酸相当于猪心脏SCOT蛋白的第305位谷氨酸残基,这一位点在SCOT蛋白中是相当保守的活性位点。DmSCOT和猪心脏SCOT蛋白在几个环的结构上存在构象的不同。最明显的不同是DmSCOT的第125-157位的氨基酸序列,这一序列形成了额外的三个β发夹结构。猪心脏SCOT和DmSCOTCoA结合位点的重合结构表明CoA结合位点的氨基酸残基是高度保守的,猪心脏SCOT中结合CoA的口袋同样存在于DmSCOT蛋白。
【作者】王义翠；
【导师】张敏；
【作者基本信息】安徽大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】DmSCOT；酮酸中毒；结构；

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