PylC蛋白分子克隆、表达纯化和环蛋白SFTI-1的化学合成

【摘要】论文将从两部分开始介绍。第一部分以合成吡咯赖氨酸(Pyrrolysine,Pyl)的Py1C蛋白分子克隆,重组表达；第二部分以化学合成的环肽药物向日葵胰蛋白酶抑制剂(SunflowerTypsinInhibitor-1,SFTI-1)。对PylC蛋白的结构与功能的分析鉴定是阐明其在合成吡咯赖氨酸的催化机制的重要内容之一,揭示其催化的反应与底物以及ATP的相互作用的具体机制,为阐明吡咯赖氨酸合成的具体反应步骤提供支持,将会有助于理解吡咯赖氨酸合成的具体机制。吡咯赖氨酸是近年发现的天然基因编码的第22个氨基酸,在产甲烷杆菌属里由特异性的甲基转移酶(MtmB、MtbB、MttB)对其特异性底物MMA、DMA和TMA反应生成甲烷的和碳源的同化作用。这种高度表达非同源的基因编码的这些甲基转移酶在合成全序列的蛋白质时,编码框内的UAG琥珀酰密码子不是起转录终止作用而是编码形成毗咯赖氨酸,首先发现这个现象是在甲烷甲基转移酶(MtmB)的基因中发现,后来在编码二甲烷甲基转移酶(MtbB)和三甲烷甲基转移酶(MttB)中也发现了同样的现象,虽然这三个基因序列不存在同源性但都编码UAG生成Pyl。已有在大肠杆菌中转入古生菌甲烷杆菌的pylTSBCD基因可以在蛋白质上掺入内源合成的Pyl。解码UAG编码成Pyl需要pylT4-6产生tRNAPy1(又称tRNACUA)而py1S编码合成毗咯赖氨酸tRNA合成酶Py1S。pylB,pylC和pylD基因在tRNA非依赖性的吡咯赖氨酸合成中是必须的三个基因。在翻译过程中,Pyl是生物合成的单独的氨基酸,与其他20种氨基酸掺入序列中的方式相同,Pyl连接到同源的pylT衍生的tRNA上通过特异性的氨基酰tRNA合成酶py1S。这里有了关于合成毗咯赖氨酸的合理推测：由Py1B,PylC和Py1D三个连续的酶促反应将两个赖氨酸合成吡咯赖氨酸,由最近报道Py1B是一个TIM桶形蛋白,赖氨酸通过自由基机理转换到3R-甲基-D-鸟氨酸(3MO),PylC连接中间产物3MO到赖氨酸分子的ε-氨基基团,由一个ATP依赖的异肽键形成。最后,Py1D催化的氧化Py1C产物L-赖氨酸盐酸Nε-3R-甲基-D-鸟氨酸。环肽通过首尾方式和尾尾方式连接的多肽主链作为一个药用医学和生物化学的很有用的医学工具。与线性肽相比,环肽产生了构象约束的类似物具有改进的生物活性,选择性,生物利用度和受体结合亲和力更高。向日葵胰蛋白酶抑制剂是天然的环肽含有14个氨基酸残基,是目前知道的最小且最有活性的胰蛋白酶抑制剂。是作为蛋白酶抑制平台一个很有潜力的候选者。但是SFTI-1的生物合成和环化机制仍然不清楚,导致生物表达的产量不高。所以就有了化学合成方面的发展,化学合成包括Boc法和Fmoc法,Fmoc法较为常见,基于此,许多研究小组报道SFTI-1的使用固相合成Fmoc化学与SFTI-1的溶液中或在树脂上的环化方法。尽管有了这些改进,但仍然都需要努力克服目前的限制,例如：相对长的时间(16-24小时),较高的温度和硫酯的合成和其替代物环化步骤的耗时。本文中,我们通过肽酰肼的连接报道了具有高效率和节省时间的合成SFTI-1的方法。我们发现基于酰肼类和天然化学连接的优点,SFTI-1的合成产率可以增加。
【作者】陈轶群；
【导师】张敏；
【作者基本信息】安徽大学，生化与分子，2014，硕士
【关键词】吡咯赖氨酸；PylC；环肽；SFTI-1；多肽酰肼；

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