家蚕主要协助转运蛋白基因BmMFS的研究

【摘要】膜蛋白在生物体的生命活动中不可或缺，主要承担细胞内外环境物质和能量的交换。大多数的药物以膜蛋白为靶点，因此解析膜蛋白的结构对于药物设计起着非常重要的作用。然而膜蛋白由于天然含量低，分离提纯困难以及克隆表达的缺陷等因素导致研究进展缓慢。主要协助转运蛋白超家族（majorfacilitatorsuperfamily，MFS）是一个主要的次级膜转运蛋白超家族。由于转运底物的多样性，使得它们在细胞能量代谢和物质交换过程中起重要作用。MFS超家族在低等生物和高等生物中广泛存在，成员众多。由于膜蛋白的结构解析存在很多困难，到目前为止，只有5种MFS蛋白结构被解析清楚，且全部来源于细菌。家蚕中未见该蛋白的相关报道。多角体蛋白（Polyhedrin，Polh）是昆虫杆状病毒感染昆虫后晚期高效表达的一种结构蛋白，分子量约为29kD，其形成的包涵体可在pH10.8以上的缓冲液中溶解。本实验室研究发现，多角体蛋白自N端起的20个氨基酸残基的片段（Ph20）保留了多角体晶体的部分特性，在pH值回调至8.0时融合蛋白依然存在于上清中。利用这种特性，可将外源基因与Ph20基因融合表达，通过调节pH简单纯化目的蛋白。在本实验室家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条ORF为915bp的序列，通过生物信息学分析发现，其编码的蛋白含有304个氨基酸残基，是一个含有六个跨膜区的蛋白，包含一个MFS保守结构域，将其命名为BmMFS。构建重组质粒pET-32a-Ph20-BmMFS，在Ph20和BmMFS基因中间引入凝血酶（Thrombin）酶切位点的核酸序列。转化E.coliRosetta，1mMIPTG诱导融合蛋白表达。利用Ph20的溶解特性通过调节pH进行初步纯化，镍柱亲和层析进一步纯化，经Westernblotting和质谱鉴定该融合蛋白为Ph20-BmMFS。利用家蚕杆状病毒表达系统构建重组病毒vPh20-BmMFS，感染家蚕BmN细胞，细胞发病后经Westernblotting检测，结果显示融合蛋白成功表达。荧光定量PCR结果显示，BmMFS基因在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平存在明显差异，中肠最高，气管最低。亚细胞定位分析表明，BmMFS蛋白存在于细胞膜上。最后应用RNA干扰技术研究BmMFS基因的功能，结果表明该基因表达沉默后，细胞增殖速度减慢。多角体蛋白片段Ph20基因和膜蛋白基因的融合表达，提高了膜蛋白的表达量，简化了纯化过程，为膜蛋白的结晶创造了条件。
【作者】郭庆拓；
【导师】吕正兵；张耀洲；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】家蚕；多角体片段；融合表达；膜蛋白；BmMFS；

【参考文献】
[1]卢涛.奥巴马政府对华实施金融外交策略的动因、目的与中国的对策研究[D].苏州大学,国际关系,2012,硕士.
[2]庄晓蕙,刘庆欢,何雪萍,蒋玲.我国个性化作业研究:现状、问题与展望——基于读秀学术搜索数据库与中国知网期刊全文数据库的数据分析[J].教育学术月刊,2014,10:104-111.
[3]李琳.常见饮料和食用油中邻苯二甲酸酯类塑化剂的检测与分析[D].沈阳师范大学,应用化学,2014,硕士.
[4]田冠雄.我国地方政府执行力提升研究[D].东北师范大学,行政管理,2012,硕士.
[5]苏承湘,柳燕,张拥军.电脉冲式转速表的研究及其应用[J].矿业研究与开发.1999(05)
[6]方婷.蜂窝状微孔结构聚酯改性纤维及其针织物性能研究[D].河北科技大学,服装设计与工程,2012,硕士.
[7]余瑾.文化普同性和差异性在政经类演讲汉英翻译中的处理[D].对外经济贸易大学,英语,2004,硕士.
[8]张晋.以煤气化为核心的多联产系统的能量分析[D].清华大学,工程热物理,2003,硕士.
[9]陈琳.无线传感器网络中的任务分配算法[D].北京邮电大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[10]韦丹丹.重金属胁迫下植物促生菌对大麻（Cannabis sativa L.）生长调控的研究[D].南京农业大学,植物学,2012,硕士.
[11]刘宇.孙嘉淦伪稿案与乾隆朝政治[D].吉林大学,中国古代史,2004,硕士.
[12]王莹.地震作用下圆钢管混凝土桥墩的力学性能研究[D].长安大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[13]李响.健脾益肾法对于癌病合并抑郁状态辨证为脾肾亏虚型的临床疗效观察[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[14]马骏骄.基于RS-485总线的实验教学系统研究[D].大连理工大学,机械制造及其自动化,2004,硕士.
[15]张甲辉.工程项目工期风险作用路径及防范研究[D].重庆大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[16]赵国亮.基于FPGA的1024点流水线结构FFT算法的研究与实现[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2011,硕士.
[17]左超.激光成像雷达距离像拼接技术[D].国防科学技术大学,信息与通信工程,2012,硕士.
[18]郑颖萍.高中数学函数内容教学研究[D].东北师范大学,教育,2012,硕士.
[19]刘腾飞.针对车体遮挡的车流量统计算法[D].武汉理工大学,应用数学,2012,硕士.
[20]蒋东旭.民族平等的实现[D].吉林大学,宪法学与行政法学,2014,硕士.
[21]徐文娟.流动儿童同辈群体社会支持的探究[D].西北大学,社会工作（专业学位）,2014,硕士.
[22]任海建.不同植被覆盖度条件下小麦生长参数的高光谱监测研究[D].南京农业大学,作物栽培学与耕作学,2012,硕士.
[23]彭忠勋.胜利油田采出水水质“达标”的技术措施[J].油田地面工程.1990(06)
[24]封晶晶.金庸武侠剧的喜剧性效果生成机制研究[D].河北师范大学,艺术学,2012,硕士.
[25]希丽雅.中国对外直接投资的区位因素[D].复旦大学,区域经济学,2012,硕士.
[26]柴文婷.长汀古城客家民居建构研究[D].华侨大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[27]赵成龙.一个基于WEB的智能答疑系统的设计与实现[D].东南大学,2005.
[28]潘巍平.江西省新建本科院校教学团队建设研究[D].南昌大学,教育经济与管理,2012,硕士.
[29]汪德根.呼伦贝尔—阿尔山旅游区空间组织研究[D].安徽师范大学,人文地理学,2004,硕士.
[30]李莉.Presenilins条件性双基因敲除小鼠超微结构的增龄性变化及运动能力的研究[D].华东师范大学,生物医学,2013,硕士.
[31]刘睿.老年性高血压病患者体质类型与心血管危险因素的相关性研究[D].北京中医药大学,中医内科,2013,硕士.
[32]游五洋.在信息化大潮中把握电信转型[J].电信网技术.2008(04)
[33]徐秀燕.国有控股上市公司非效率投资影响因素研究[D].河北经贸大学,会计学,2014,硕士.
[34]申保收.电弧放电法制备石墨烯及其电化学性能研究[D].兰州理工大学,2012.
[35]樊秀月.甲状腺乳头状癌颈部中央组淋巴结转移的相关因素及清扫方式的探讨[D].广西医科大学,胃肠腺体外科（专业学位）,2013,硕士.
[36]杨洪光.自重构机器人重构规划算法的研究及动力学分析[D].天津理工大学,机械工程,2013,硕士.
[37]张海燕.“绿色”火箭推进剂及其制造新工艺[J].飞航导弹.2001(12)
[38]于芳,孔令人,石义芳,陈培正.基于CRM理念的医院信息系统探讨[J].医疗设备信息,2005,11:13-15.
[39]宋晓光.绿色贸易壁垒对我国茶叶出口的影响研究[D].南京农业大学,国际商务,2013,硕士.
[40]李颖.财政科技支出项目绩效评价研究[D].山西财经大学,财政学,2014,硕士.
[41]李家旺,宋保维,邵成.自主水下航行器的变质心跟踪控制(英文)[J].自动化学报,2008,10:1319-1323.
[42]秦志发.在粤地区母语为英语的外国人普通话语音习得偏误分析[D].湖南师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[43]姜健,赵杰,李力坤.面向群智能机器人系统的声音协作定向[J].自动化学报,2007,04:385-390.
[44]胡萍.基于BPR方法论的政府采购招标流程再造[D].合肥工业大学,2005.
[45]苏静.本体调试中标签有序化及公理的扩展选择[D].吉林大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[46]步真会.周期介质中反应对流扩散方程脉动行波解的渐近行为和整体解[D].兰州大学,应用数学,2014,硕士.
[47]王明凯.利益网络下的白村赢利型经纪研究[D].中共中央党校,中外政治制度,2013,硕士.
[48]黄安琴.中国高等学校贷款负债问题研究[D].广西师范大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[49]林志毅1,王玲玲2.一种基于-支配的多目标自组织迁移算法[J].控制与决策.
[50]李丹丹.全国人大代表结构变迁研究：1954-2013[D].华中师范大学,中外政治制度,2014,硕士.