灵芝多糖拮抗黑色素瘤细胞上清对腹腔巨噬细胞免疫功能抑制作用的研究

【摘要】目的：黑色素瘤(Melanoma)是一种起源于黑色素细胞的恶性肿瘤,因其恶性程度高,预后差而对人类健康构成极大威胁。本病的发生、发展及转归与机体的免疫系统关系密切。巨噬细胞是机体天然免疫的重要执行者之一,在抗肿瘤免疫中既是抗原提呈细胞,也是杀伤肿瘤的效应细胞。其杀伤机制除了与肿瘤细胞结合,通过释放溶酶体酶直接杀伤肿瘤细胞外,还可以处理和提呈肿瘤抗原、分泌细胞因子等间接杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞也可以通过多种方式逃避机体免疫系统的攻击,抑制机体免疫功能的发挥,其分泌的多种免疫抑制分子对淋巴细胞、巨噬细胞、LAK细胞及NK细胞等免疫效应细胞均有抑制作用。灵芝多糖(GanodermalucidumPolysaccharides,Gl-PS)是植物灵芝的主要活性成分之一。灵芝多糖可以活化巨噬细胞,增加巨噬细胞一氧化氮(NO)、TNF-α的分泌。但灵芝多糖能否拮抗肿瘤细胞上清对巨噬细胞的抑制作用,尚无专题实验证实。因此,本实验研究B16F10黑色素瘤细胞培养上清液对同基因小鼠腹腔巨噬细胞的免疫功能的抑制作用,以及灵芝多糖拮抗黑色素瘤细胞培养上清对同基因小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用,探讨其机制,为肿瘤的免疫治疗提供理论依据。方法：1.细胞来源：本实验采用的B16F10黑色素瘤细胞是一种来源于C57BL/6j小鼠的高转移性黑色素瘤细胞系；腹腔巨噬细胞为新鲜制备的C57BL/6j小鼠的腹腔巨噬细胞；L929细胞是来源于小鼠的成纤维细胞。2.制备B16F10黑色素瘤细胞培养上清：2×1005/mlB16F10黑色素瘤细胞,接种于50m1培养瓶,每瓶10ml细胞悬液,培养至细胞长满瓶底80%时换液,继续培养8h,收集培养上清,0.22μm滤纸滤菌,分装,-20℃冻存备用。3.实验分组及干预：分为B16F10黑色素瘤细胞培养上清组,B16F10黑色素瘤细胞培养上清加不同浓度灵芝多糖组(0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml),RPMI-1640培养基对照组。各组均含有相同浓度的细菌脂多糖LPS10μg/ml。4.采用噻唑蓝比色(MTT)方法,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的腹腔巨噬细胞的抑制作用。5.采用中性红吞噬实验,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对巨噬细胞吞噬中性红的抑制作用。6.采用Griess方法检测NO的含量,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对巨噬细胞释放NO的抑制作用。7.采用免疫细胞化学染色方法,观察灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对腹腔巨噬细胞释放TNF-α的抑制作用。8.采用噻唑蓝比色(MTT)方法,通过L929细胞抑制实验,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对腹腔巨噬细胞释放TNF-α活性的抑制作用。9.采用蛋白印迹(Western-blot)技术,检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对腹腔巨噬细胞细胞释放TNF-α的抑制作用。10.数据统计分析：应用SPSS13.0统计学软件,对结果进行单因素方差分析,p<0.05表示差别有统计学意义。结果：1.B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的同基因小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用：未加灵芝多糖的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组腹腔巨噬细胞活性、吞噬中性红的能力、释放NO水平分别为0.411±0.035、0.596±0.10、4.830±1.384,与对照组的0.861±0.208、1.275±0.102、11.455±0.175相比,均明显降低,经方差分析,各组差异均有统计学意义(p<0.05);Western-blot及L929细胞增殖抑制实验检测腹腔巨噬细胞TNF-α表达及活性分别为3.221±0.333和0.387±0.030,与对照组的0.84±0.213和0.746±0.049相比,TNF-α的表达均明显降低,经方差分析,各组差异均有统计学意义(P<0.05)；免疫细胞化学染色检测B16F10黑色素瘤细胞培养上清组TNF-α的表达明显降低于RPMI-1640培养基对照组。2.灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的腹腔巨噬细胞的抑制作用：MTT结果显示,在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清作用的LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞OD值分别为0.439±0.041、0.492±0.037、0.679±0.051、0.818±0.123,结果明显高于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组0.411±0.035,呈一定的剂量依赖关系,但均未能达到RPMI-1640培养液对照组0.861±0.208。经方差分析,差异有显著性(F=21.339,p<0.05)。两两比较除B16F10黑色素瘤细胞培养上清组与0.2μg/ml组、0.8μg/ml组；0.2μg/ml组与0.8μg/ml组;3.2μg/ml组与12.8μg/ml组、RPMI-1640培养液对照组；12.8μg/ml组与RPMI-1640培养液对照组之间比较差异无显著性外,各组之间差异均有显著性(p<0.05)。3.灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的腹腔巨噬细胞吞噬中性红的抑制作用：在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清作用的LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的OD值分别为0.686±0.056、0.765±0.037、0.778±0.046、0.787±0.057,结果明显高于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组0.596±0.100,呈一定的剂量依赖关系,但均未能达到RPMI-1640培养液对照组1.275±0.102。经方差分析,差异有显著性(F=67.054,p<0.05)。两两比较除B16F10黑色素瘤细胞培养上清组与0.2μg/ml组；0.2μg/ml组与0.8μg/ml组、3.2μg/ml组、12.8μg/ml组；0.8μg/ml组与3.2μg/ml组、12.8μg/ml组;3.2μg/ml组与12.8μg/ml组之间比较差异无显著性外,各组之间差异均有显著性(p<0.05)。4.灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的腹腔巨噬细胞释放NO的抑制作用：在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清作用的LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞释放NO值分别为5.749±1.109、5.717±1.131、6.081±1.597、8.060±1.375,结果明显高于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组4.830±1.384,但均未能达到RPMI-1640培养液对照组11.455±0.175。经方差分析,差异有显著性(F=12.032,p<0.05)。两两比较B16F10黑色素瘤细胞培养上清组和各不同浓度灵芝多糖组之间差异无显著性,与RPMI-1640培养液对照组之间差异均有显著性(p<0.05)。5.免疫细胞化学染色检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-a的抑制作用：在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞的抑制作用明显减低,巨噬细胞TNF-a表达增加,免疫细胞化学染色阳性程度明显高于未经灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组,但均低于RPMI-1640培养液对照组。6.L929细胞增殖情况检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-a的抑制作用：经含有不同浓度灵芝多糖的B16F10黑色素瘤细胞培养上清作用同基因小鼠腹腔巨噬细胞24h后的培养上清作用L929,48h后L929细胞OD值分别为0.600±0.032、0.599±0.084、0.550±0.076、0.496±0.045,结果明显低于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组0.746±0.049,呈一定的剂量依赖关系,但均未能达到RPMI-1640培养液培养的巨噬细胞上清培养组0.387±0.030,各组结果均明显低于RPMI-1640培养液对照组0.897±0.038。经方差分析,差异有显著性(F=57.145,p<0.05)。两两比较除0.2μg/ml组与0.8μg/ml组、3.2μg/ml组；0.8μg/ml组与3.2μg/ml组;3.2μg/ml组与12.8μg/ml组之间比较差异无显著性外,各组之间差异均有显著性p<0.05)。7.Western-blot方法检测灵芝多糖拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-α的抑制作用：在不同浓度灵芝多糖作用下,B16F10黑色素瘤细胞培养上清对LPS诱导24h后的同基因小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达的抑制作用明显减低,相对表达量分别为1.068±0.243、1.367±0.138、1.753±0.083、2.006±0.323,明显高于未用灵芝多糖作用的B16F10黑色素瘤细胞培养上清组0.84±0.21,且呈剂量依赖关系,但均低于RPMI-1640培养液对照组3.221±0.333。经方差分析,差异有显著性(F=38.296,p<0.05)。两两比较除B16F10黑色素瘤细胞培养上清与0.2μg/ml组；0.2μg/ml组与0.8μg/ml组;0.8μg/ml组与3.2μg/ml组；3.2μg/ml组与12.8μg/ml组之间比较差异无显著性外,各组之间差异均有显著性(p<0.05)。结论：1.B16F10黑色素瘤细胞培养上清对同基因小鼠腹腔巨噬细胞有免疫抑制作用。2.灵芝多糖可拮抗B16F10黑色素瘤细胞培养上清对同基因小鼠腹腔巨噬细胞的免疫抑制作用。
【作者】兰天飞；
【导师】陆洁；孙立新；
【作者基本信息】承德医学院，肿瘤学，2011，硕士
【关键词】灵芝多糖；黑色素瘤；腹腔巨噬细胞；LPS；NO；TNF-α；

【参考文献】
[1]李庆坤.吉林省查干湖湿地恢复保护中洪水资源利用与配置研究[D].河海大学,水利水电工程,2003,硕士.
[2]陈辉.激光焊接关键技术的研究[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[3]戴松佐.出租屋入室盘查问题研究[D].西南政法大学,警察科学,2012,硕士.
[4]李少华.HGB和POE增强增韧PP泡沫复合材料的制备与性能研究[D].南京航空航天大学,材料加工工程,2013,硕士.
[5]吴霙斐.中职学生思想政治教育实效性研究[D].苏州大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[6]孙玲琴.目的论指导下的英语报刊科技新闻汉译[D].湖南师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[7]杨杰,徐炜民.搜索引擎技术的运用与研究[J].计算机工程,2002,01:266-267+275.
[8]何龙祥.日照钢铁360m~2烧结机过程自动控制系统的分析与设计[D].河北工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[9]周期玉.马尔库塞人本主义批判理论评析[D].湘潭大学,外国哲学,2003,硕士.
[10]胡冬润.面向网络舆情任务的本体学习方法研究[D].南京航空航天大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[11]张屹.牛部分脱蛋白异种骨复合自体红髓在治疗枪伤后骨缺损中的实验研究[D].第四军医大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[12]于猛.冻融—酶法相结合的生物质预处理研究[D].陕西科技大学,生物化工,2013,硕士.
[13]李视磊.中小企业板上市公司财务绩效评价体系研究[D].浙江工业大学,2009.
[14]邓明星,刘冠峰,张国英.基于Delta并联机器人的传送带动态跟踪[J].机械工程与自动化,2015,01:153-154+156.
[15]韩飞,张小华.解析强电工程材料的设备制造[J].科技与企业,2014,04:180.
[16]郑刚民.基于谱图理论的非线性流形学习算法研究[D].苏州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[17]任丽红,王皓,李克元.定量包装秤夹袋手柄根部折断受力分析[J].一重技术.2002(01)
[18]鲁睿.当代城市公共艺术及其审美批判[D].武汉纺织大学,美学,2014,硕士.
[19]卢骏安.富勒烯的化学修饰与表征[D].沈阳师范大学,分析化学,2014,硕士.
[20]李杨.维拉帕米预防兔膝关节术后粘连的疗效及机制研究[D].天津医科大学,外科学（专业学位）,2014,博士.
[21]李传民.MiR-29对PRRSV在PAM中复制的影响及其靶基因验证[D].吉林大学,动物遗传育种与繁殖,2014,硕士.
[22]瞿春花.论宗璞小说的个人化叙事[D].浙江大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[23]王磊.黄土沟谷地区桥梁桩基加固技术的应用研究[D].长安大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[24]牟静.带教老师护理安全认知现状及其对实习护生护理安全行为的影响[D].山东大学,护理学,2012,硕士.
[25]王成程.并联混合动力装载机自动换挡规律研究[D].吉林大学,机械电子工程,2014,硕士.
[26]曹宇澄.泰国铁路通信信号工程中的计算机联锁系统[J].铁道通信信号.2005(08)
[27]于蓉蓉,魏学业,吴小进,覃庆努.一种改进型预测电流控制算法[J].电工技术学报,2010,07:100-107.
[28]曹磊.欠发达地区小城镇建设问题研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[29]张斌.聚类算法研究及在客户忠诚度分析中的应用[D].青岛大学,2003.
[30]王鸿,冯宇美,吴祺豪,周峰,赵美蓉.海洋真菌MucorcircinelloidesMNP12010102的次级代谢产物研究[J].浙江工业大学学报,2014,05:487-490.
[31]李梦姣.菱铁矿—双氧体系去除地下水1，2-二氯乙烷及有机质的影响[D].中国地质大学（北京）,地下水科学与工程,2014,硕士.
[32]敖敦其木格.儿童思维发展的逻辑程序[D].内蒙古师范大学,逻辑学,2013,硕士.
[33]刘小红.高校辅导员工作压力与工作倦怠现状及关系研究[D].杭州电子科技大学,思想政治教育,2011,硕士.
[34]郭京京.生态约束下的山区基本农田划定研究[D].华中师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[35]李圆.高速汽油机进气及缸内燃烧过程研究[D].湖南大学,动力工程及工程热物理,2014,硕士.
[36]潘霄.猪伪狂犬超强毒株的分离鉴定及非编码短片段DNA文库的构建[D].河南科技大学,兽医（专业学位）,2013,硕士.
[37]韩海雷.中国古代龙文化影响下的古代建筑研究[D].河北工业大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[38]王娟.RKIP表达下调对宫颈癌细胞的影响[D].青岛大学,妇产科学,2013,硕士.
[39]河北付俊.能几秒充满电的新型电池[N].电子报,2013-03-31013.
[40]高则宝.人类知识辅助的GUI测试脚本修复技术[D].南京大学,应用软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[41]边亚伟.高尔吉阿斯《海伦颂》义疏[D].西南交通大学,比较文学与世界文学,2014,硕士.
[42]刘杰.基于LabVIEW的航空机电计算机测试系统设计与开发[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2012,硕士.
[43]贾高文.云南临沧晚中新世豆科（黄檀属、金合欢属和槐属）化石研究[D].兰州大学,古生物学与地层学,2013,硕士.
[44]解学军,吴昭景,张嗣瀛.时变系统具有MT-滤波器的反推自适应控制[J].控制与决策,2003,04:392-397.
[45]姜理英,曹书岭,朱润晔,陈建孟,苏飞.介质阻挡放电对氯苯的降解特性及其产物分析[J].环境科学,2015,03:831-838.
[46]孙冰洁.真空法制备冰浆的数值模拟和理论研究[D].山东大学,制冷及低温工程,2013,硕士.
[47]钟小红.美的集团财务共享管理研究[D].湖南大学,工商管理,2013,硕士.
[48]张巍.PCI手术前后CGRP、HMGB1的变化及其与再狭窄临床相关性因素的研究[D].遵义医学院,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[49]杨越.基于核酸适配子技术检测环境中重金属离子的研究[D].吉林大学,2012.
[50]孟令曾,高秀霞,陈进.小果野芭蕉种子散布和不同时空尺度上种子被捕食格局[J].植物生态学报,2008,01:133-142.