消减免疫法筛选HPV型间杂合颗粒特异单克隆抗体及其表位研究

【摘要】人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)的持续感染被证实是诱发女性宫颈癌的主要原因。世界范围内,每年由HPV感染所致癌症病例56万例,约占全球全部癌症新发病例的5%,死亡人数约20万；在中国,每年约有10万的妇女因HPV感染而导致宫颈癌,死亡病例约3万。宫颈癌是继乳腺癌之后严重威胁妇女健康的第二大疾病。与宫颈癌密切相关的高危型HPV有15种,要有效控制宫颈癌就必须有预防这15种型别HPV感染的疫苗。目前上市的2种疫苗只能预防HPV16和HPV18这两种高危型的感染,保护率约占70%。因此,开发多价预防疫苗具有重大意义,同时也面临巨大的挑战。本文在实验室前期的研究基础上,通过HPV16L1的C175和HPV52L1的C428位点突变,获得两种突变蛋白,混合组装成均一的、与野生型VLP形态相似的杂合病毒样颗粒(VirusLikeParticle,VLP)。通过免疫原性考察,相同剂量的杂合VLP与野生型VLP所诱导的抗体水平相当,表明杂合VLP有作为广谱HPV疫苗的潜力。由于杂合VLP两个相邻五聚体之间只能形成一个二硫键,在空间结构上必然与野生型VLP不同,因此,杂合VLP有可能会产生新的功能表位,甚至可能产生新的广谱表位。因此,筛选出针对杂合VLP特异反应的单抗,同时通过该抗体分析杂合VLP相对于野生型VLP所产生的新表位具有重要意义。本研究首先通过单克隆抗体筛选获得了针对于杂合VLP特异反应的单抗。在常规的免疫方法中,HPV杂合VLP的免疫血清抗体滴度与两种野生型免疫的抗体滴度相当,筛选获得的抗体差异性不大,且没有针对杂合VLP新表位的单抗。因此本研究采用环磷酰胺消减免疫法,环磷酰胺可以抑制非目的抗原的免疫原性,提高免疫系统对目的抗原的应答。本文针对HPV抗原的免疫进行一系列摸索,最后建立的消减免疫方案是：耐受阶段和免疫阶段均不使用佐剂,抗原剂量为20μg,腹腔注射,环磷酰胺剂量为100mg/kg。对消减次数的研究表明,耐受次数不影响免疫抑制的持久性,停止环磷酰胺处理后,免疫抑制状态可以维持4周。本研究中,先使小鼠免疫系统对HPV16和HPV52野生型VLP的免疫无应答,再以杂合VLP免疫小鼠,使少量的五聚体杂合特异的表位免疫应答得到加强,提高特异抗体的阳性率,减少筛选工作量。筛选获得的抗体中,有2株抗体对杂合VLP特异,4株抗体对杂合VLP和野生型VLP的反应差异性在10倍以上。证实了环磷酰胺消减免疫法可以有效地制备差异性抗体。我们接着利用分子模拟方法,对以上抗体识别的表位进行分析。选取杂合VLP的特异性抗体2B3,分别对抗体可变区和HPV16/52相邻五聚体进行同源模建和分子对接,预测出2B3与杂合VLP的相互作用区域在两个五聚体之间,关键氨基酸是HPV16五聚体的Ser170和Lys439,HPV52五聚体的Asn240、Ser255、Glu378、Lys382和Glu469。综上所述,本研究通过对消减免疫方案的研究,建立了以HPV为抗原的消减免疫方案,由此筛选获得了杂合VLP特异性抗体和与野生型VLP具有较大差异性的抗体。利用生物信息学分子对接技术,进一步研究了特异性抗体识别的杂合VLP的特异表位。本研究获得的杂合VLP特异表位信息,对于了解HPVL1蛋白的分子进化,中和表位型别的特异性,杂合VLP组装的机制以及开发基于杂合VLP的HPV广谱疫苗具有重要的指导意义。
【作者】陆剑；
【导师】张军；
【作者基本信息】厦门大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】人乳头瘤病毒；型间杂合病毒样颗粒；消减免疫；表位；分子模拟；

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