Ephrin-B2对人脐静脉内皮细胞功能的影响及其蛋白质组学研究

【摘要】目的在蛋白质组学水平上研究ephrin-B2对人静脉内皮细胞(HUVECs)蛋白质表达的影响,探索其参与的主要的生物功能和信号通路及可能作用机制。并探究ephrin-B2对HUVECs增殖、迁移的作用和对细胞周期的影响以及增殖存活相关蛋白表达的变化,确证蛋白质组学的研究,为在蛋白质组水平上探讨ephrin-B2对HUVECs细胞功能和信号通路的影响以及对细胞增殖迁移的作用机制研究提供新的思路,并为探究它在心肌缺血中的重要性和将来成为血管生成方面的治疗剂的候选蛋白提供科学研究依据。方法用酶消化揉搓法提取原代HUVECs并进行培养和传代,运用SILAC同位素标记技术对培养的HUVECs进行标记,分别以1μg/mL的ephrin-B2/Fc和PBS处理标记的HUVECs15h,分别提取处理组和对照组蛋白后以1：1混合,运用液相色谱质谱联用技术检测HUVECs内蛋白质表达的变化,IPA软件进行生物信息学分析,分析其参与的生物功能、经典信号通路、相互作用网络等,并预测其下游效应；用WesternBlot技术检测增殖存活相关蛋白表达的变化；用cck-8法在既定的时间点(1、3、5、7d)观察不同浓度的ephrin-B2/Fc(0、0.01、0.03.0.1、0.3、1μg/mL)对HUVECs增殖的影响(各组n=6),运用流式细胞技术观察该蛋白对内皮细胞细胞周期的影响,并运用Transwell和划痕试验观察不同浓度的ephrin-B2/Fc(0.0.1、0.3、1、3μg/mL)对HUVECs迁移的作用,从而观察其对内皮细胞血管新生的调控。结果蛋白质组学分析结果显示,ephrin-B2/Fc处理后,HUVECs内细胞骨架蛋白表达明显上调,细胞存活、增殖、迁移相关多条信号通路激活,预测其具有减少细胞凋亡、自噬,促进细胞增殖、迁移和运动的作用；WB结果显示,ephrin-B2/Fc促进了细胞存活、增殖相关蛋白Bcl-2、c-Myc、NPM表达的上调,而凋亡相关蛋白BAX表达亦有所上调。增殖迁移结果显示,ephrin-B2/Fc促进HUVECs的增殖,并呈浓度依赖性增加；在0～1μg/mL的浓度范围内,ephrin-B2/Fc对HUVECs的迁移作用呈浓度依赖性促进,但当浓度为3μg/mL时其促迁移作用消失；流式细胞结果分析显示1μg/mLephrin-B2/Fc处理组,G0/G1期细胞比例显著降低(P<0.05),S期细胞比例增高(P<0.05)。结论Ephrin-B2上调HUVECs内细胞骨架蛋白、增殖存活相关蛋白的表达,激活增殖迁移相关信号通路,参与细胞存活、增殖、迁移等细胞功能的发挥,促使细胞由G0/G1期进入S期。在一定浓度范围内ephrin-B2促进了HUVECs的增殖和迁移,当超过一定浓度,其促迁移作用消失。
【作者】郑丽春；
【导师】王挹青；
【作者基本信息】厦门大学，内科学，2014，硕士
【关键词】ephrin-B2/Fc；增殖；迁移；蛋白质组；质谱；

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