基于分子逻辑门的食源性致病菌DNA检测技术研究

【摘要】分子逻辑门最早是由DeSilva教授及其研究小组提出,他们于1993年首次将分子开关发展为分子逻辑门并在Nature期刊上报道了一种基于光诱导电子转移的分子逻辑门。本论文利用DNA分子逻辑门技术结合电化学方法,实现了对多种食源性致病菌的特征DNA进行检测。通过构建标记型发卡结构DNA分子逻辑门、标记发卡型茎部三螺旋结构DNA分子逻辑门、非标记型三螺旋结构DNA分子逻辑门,分别实现了对大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA、沙门氏菌DNA这三种食源性致病菌的同时准确有效检测。本论文主要内容如下：(1)绪论部分首先以食品安全与食源性致病菌检测对保障食品安全的重要意义出发介绍食源性致病菌检测的主要方法,且阐述了各类方法的研究进展,对传统方法与现代方法的优缺点做了对比,重点介绍了本论文中应用的检测方法—DNA生物传感器对食源性致病菌的检测方法。绪论后半部分介绍了分子逻辑门的概念,以及与本论文研究方法密切相关的DNA分子逻辑门的分类及其研究进展。(2)构建了一种基于二茂铁标记型发卡结构检测大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA的“OR”型逻辑门。依据文献及相关数据库,借助专业软件模拟计算,选择合适的大肠杆菌特征基因序列、志贺氏菌特征基因序列。将其特征DNA作为目标分子,由此设计符合条件的二茂铁标记型发卡结构的DNA探针。以大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA作为输入,修饰标记二茂铁探针分子的电极电流响应信号作为输出,构建OR型逻辑门。达到快速同时检测大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA的目的。当输入大肠杆菌DNA、志贺氏菌DNA中任意一个或同时输入两个目标DNA分子时,电流减小率>54%,当没有目标DNA出现时,电流减小率<54%。检测E.coli-DNA所得结果：回归方程为：y=-0.0027x+4.575,相关系数R=0.9962,其线性范围为：1.0×10-7-7.0×10-7mol/L,检出限：1.0×10-7mol/L。检测Shi-DNA所得结果：回归方程y=-0.0037x+4.54,相关系数R=0.9973,线性范围为：1.0×10-7-7.0×10-7mol/L,检出限：1.0×10-7mol/L。(3)构建了一种基于二茂铁标记型发卡茎部三螺旋结构检测沙门氏菌DNA、志贺氏菌DNA的“OR”型逻辑门。参考相关数据库,确定志贺氏菌特征基因序列、沙门氏菌特征基因序列。借助软件进行模拟计算,选择合适的志贺氏菌、沙门氏菌特征基因序列检测目标,在上一个实验原理基础上加以改进,设计二茂铁标记型茎部三螺旋结构的发卡式DNA探针。以志贺氏菌DNA、沙门氏菌DNA作为输入,修饰标记二茂铁探针分子的电极电流响应信号作为输出,构建OR型逻辑门。达到同时快速检测志贺氏菌DNA、沙门氏菌DNA的目的。当输入沙门氏菌DNA、志贺氏菌DNA中任意一个或同时输入两个目标DNA分子时电流减小率>83%,当没有目标DNA出现时,电流减小率<83%。检测Sal-DNA所得结果：回归方程为:y=-1.291og(Csal/mol)-6.819,相关系数R=0.9974,线性范围：3.0×10-7-2.5-l0-11mol/L,检出限：2.5×10-1lmol/L。检测Shi-DNA所得结果：回归方程y=-1.261og(Cshi/mol)-6.496,相关系数R=0.9965,线性范围为3.0×10-7-2.5×10-11mol/L,检出限：2.5×10-11mo1/L。(4)在前期工作基础上,构建了一种非标记型三螺旋结构同时检测志贺氏菌DNA、沙门氏菌DNA的“AND”型逻辑门。选择合适的志贺氏菌特征基因序列、沙门氏菌特征基因序列并设计非标记型三螺旋DNA探针。选用亚甲基蓝作为电化学活性指示剂,利用亚甲基蓝与DNA的相互作用,分别探究单链DNA、双链DNA、三链DNA的杂交信号响应。以志贺氏菌DNA、沙门氏菌DNA作为输入,以亚甲基蓝为指示剂的电极电化学信号作为输出,构建AND型逻辑门。达到快速同时检测志贺氏菌、沙门氏菌DNA的目的。检测Sal-DNA所得结果：回归方程为:y=-1.2071og(Csal/mol)x+14.172,相关系数R=0.9986,线性范围为：2.0×10-7-3.5×10-11mo1/L,检出限：3.5×10-11mol/L。检测Sal-DNA所得结果：回归方程为y=-3.1031og(Cshi/mol)-7.34,相关系数：R=0.9967,线性范围为：2.0×10-7-3.5×10-11mol/L,检出限：3.5×10-11mol/L。
【作者】余然；
【导师】倪刚；晋晓勇；
【作者基本信息】宁夏大学，应用化学，2014，硕士
【关键词】生物传感器；分子逻辑门；DNA检测；三螺旋结构DNA；食源性致病菌；

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