TNF-α抑制剂的筛选和C_2D机理研究

【摘要】肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)是一种具有广泛生物活性的细胞因子,但过量表达的TNF-α和受体结合后可以导致机体发生炎症等反应,是目前临床上诱发多种疾病的主要原因。所以寻找有效的、毒副作用小的小分子TNF-α抑制剂,使其达到阻断TNF-α过量产生或者抑制下游信号通路的传递,便能够有效地治疗相关疾病,具有重要的临床意义。首先,本论文采用小鼠成纤维细胞L929细胞系建立了TNF-α抑制剂筛选研究的细胞模型,对1031个微生物来源的天然产物以及合成化合物进行筛选。结果在化合物浓度为20μM和10μM,TNF-α浓度为3ng/mL时,1031个化合物中有34个能使细胞存活率提高到50%以上,占总化合物的3.3%。这些化合物中有5个天然产物和1个合成化合物表现出了较好的抗TNF-α活性,是较有前景的抗TNF-α先导化合物。其次,本论文对另外一个抗TNF-α小分子天然产物C2D的活性机理进行了初步探究,采用CCK-8、流式细胞术、Westernblot等试验方法检测C2D对TNF-α刺激下ROS和信号通路的影响,得到了如下结论：(1)C2D本身在100μM以下对L929细胞并没有毒性,并且可以提高TNF-α刺激下L929细胞的存活率,且表现出了浓度的依赖性。(2)流式细胞术实验显示C2D能够减少L929细胞因TNF-α刺激而产生过量的ROS,Westernblot实验结果则显示C2D主要影响了p38的活性,表现为p38的激活作用,使p-p38含量上调。最后,在探究C2D作用机理的同时,还意外的发现当10ng/mL的TNF-α作用于L929细胞90min时,Westernblot的结果显示RIP3突然减少,之后又很快回到TNF-α刺激的状态。采用Westernblot、Real-timeqPCR、co-IP等试验方法,得到如下结果：(1)TNF-α作用于L929细胞1h～2h时,RIP3在RNA水平上和空白对照组差异不大,但是其泛素化程度却比对照组要高。(2)在TNF-α作用90min时,RIP1和RIP3结合量减少。(3)在TNF-α作用90min时,被caspase-8切割的RIP3增多。(4)在TNF-α作用90min时,NF-κB的入核量增多。所以我们认为在TNF-α刺激L929细胞1h-2h的时间段内,细胞会因自主适用刺激而表现出自我修复功能。此时RIP1和RIP3结合减少,避免细胞发生坏死。当刺激不断进行时,细胞因无法抵抗长时间的刺激,开始走向坏死。本论文对抑制TNF-α的化合物筛选和TNF-α下游作用机理的研究将对开发有自主知识产权的TNF-α抑制剂新药做出积极的贡献。
【作者】王苹苹；
【导师】徐庆妍；
【作者基本信息】厦门大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】TNF-α；C2D；RIP3；

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