肌醇氧化酶在大肠杆菌中的高效表达及其催化生产葡萄糖醛酸的特性研究

【摘要】葡萄糖醛酸在医药和保健品等领域都有广泛的应用。但目前葡萄糖醛酸的工业生产主要是通过硝酸氧化法等化学合成手段,存在产品收率低、环境污染严重、成本高等问题。本文的主要目的是建立以生物法合成葡萄糖醛酸的新方法,探索更经济、有效和环境友好的葡萄糖醛酸合成新途径。首先将全合成的肌醇氧化酶(MIOX)基因连接至(?)pET28a(+-)载体,构建表达载体pET28a(+)-MIOX,并以E.coliBL21(DE3)为宿主菌实现表达。对重组菌EcoliBL21(DE3)/pET28a(+)-MIOX表达肌醇氧化酶的条件进行了优化,结果表明目标蛋白在对数生长期中期以0.1mMIPTG在26℃下诱导表达8h时,酶活最高可达45.4kU/L。由于融合表达的肌醇氧化酶带有His标签,开展了Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白的研究,实现了高回收率(63%)和高比活(610U/mg)产物。对纯化得到的肌醇氧化酶的酶学性质进行初步分析。结果表明纯化肌醇氧化酶催化反应的最适pH值为6.5,最适温度为30℃。然后开展利用重组菌体作为催化剂以肌醇为底物生产葡萄糖醛酸的研究。首先考察完整细胞和粗酶液对葡萄糖醛酸产量的影响,发现整细胞催化效率最高。其次,对整细胞催化反应条件进行优化,确定最佳反应条件：在5mLMOPS缓冲体系(pH7.5)中,初始菌体浓度为20g/L(DCW),肌醇浓度为2g/L,于30℃,100r/min条件下反应2h。在这一最优条件下,葡萄糖醛酸产量达2.13g/L,肌醇转化率近99%。最后,考察在反应过程中添加新鲜菌体对转化效率的影响,分别于反应2、4、6h时添加菌体,每次菌体添加量5g/L(DCW),随着菌体的添加,葡萄糖醛酸产量逐渐升高,当第三次添加菌体后,葡萄糖醛酸产量趋于最大值15.7g/L。
【作者】郑书香；
【导师】蔡谨；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2013，硕士
【关键词】葡萄糖醛酸；肌醇氧化酶；E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-MIOX；肌醇；亲和层析；

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