分枝杆菌降解植物甾醇侧链过程基础研究

【摘要】植物甾醇侧链降解反应是甾体转化领域主要研究方向之一,其产物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)在甾体药业中占有重要地位,因为从它们出发几乎可以合成所有的甾体激素类药物。采用微生物发酵法降解植物甾醇侧链,生产AD(D)等甾体类药物中间体是目前的研究热点,但甾体底物水溶性差限制了微生物法的大规模应用。本文利用分枝杆菌Mycobacteriumsp.MB3683对植物甾醇侧链降解过程进行研究,以改善底物溶解性,实现高浓度下的植物甾醇侧链降解过程。首先建立了产物AD的HPLC分析方法,该方法操作简单、重复性好、结果可靠。测定了分枝杆菌在发酵培养基中的生长曲线。对培养基和培养条件包括碳源、氮源和pH等进行了优化,发现葡萄糖浓度高时不利于甾体的转化,而氮源(NH4)2HPO4对AD产率的影响较小,但对维持体系的pH非常重要。并确定适宜的发酵转化时间为168h。其次选取多种有机溶剂、环糊精及其衍生物作为增溶剂,以探讨不同甾醇底物对增溶剂的偏好性,并对增溶剂添加时间、添加量、底物的投料浓度等操作条件进行了研究。结果表明,植物甾醇(混合甾醇)最适于作为转化底物；不同甾醇底物对增溶剂无明显偏好性。有机溶剂作为增溶剂时,乙醇和丙酮在提高产率方面优于其它有机溶剂；而环糊精作为增溶剂时,甲基-β-环糊精效果最好,在底物浓度高达15g/L时,产率仍不低于60%,且发酵转化时间缩短至96h。最后选取8种植物油构建了油/水两相体系用于侧链降解反应。分别测定了产物AD在各体系中的分配系数,logD值均处于2.0-3.0之间。在底物浓度为10g/L时,葵花油和玉米油系统中的摩尔产率均超过了80%,其它油水两相系统中也可达到70%。在此基础上,选取葵花油/水两相系统作为研究对象,对相比、接种量、投料时间和发酵时间等重要参数进行了探索。结果表明在相比1：9,接种量8%,48h投料时,转化效果最好,且转化时间缩短至120h。在高浓度的底物(20g/L)条件下,产率仍有45%,充分证明了植物油/水体系在甾醇侧链降解中的可行性和优势。
【作者】徐阳光；
【导师】关怡新；
【作者基本信息】浙江大学，生物化工，2014，硕士
【关键词】分枝杆菌；侧链降解；植物甾醇；环糊精；植物油；两相催化；

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