新型柔性树脂载体的合成及对木瓜蛋白酶的固定化研究

【摘要】固定化酶不仅能保持游离酶高效、专一、温和的催化反应特性,还具有稳定性高、易分离回收、可重复使用、工艺简便、操作连续可控等优点,成为生物技术研究中最活跃的领域之一。而现有的酶固定化技术存在一定的不足,因此,合理选择和设计性能优良的固定化载体和简单有效的固定化方法对固定化酶的应用具有重要意义。本论文在综述了国内外传统酶固定化方法和固定化载体研究进展的基础上,总结出共价结合法是目前研究最为活跃的固定化方法之一,但该方法所得到的固定化酶活回收率偏低,本文在前人研究基础上采用酶的柔性共价结合固定法。这样可以减少酶在固定化过程中因刚性碰撞造成的酶活损失,同时又可最大限度地保留酶游离态的均相催化活性。从而解决共价结合法固定化酶活力回收率偏低的问题。因此本文选择具有比表面积大、稳定性高、机械强度高、表面含大量活泼氰基(C≡N)的大孔交联聚丙烯腈树脂微球(RAN)为研究对象,通过化学改性的方法,分别接枝具有亲水性的四乙烯五胺(TEPA)和氨基葡萄糖(GA)功能基,合成两种新型柔性树脂载体：PAN-TEPA和PAN-GA,用于木瓜蛋白酶的柔性固定化研究。本课题对柔性树脂载体的合成条件、酶固定化过程中的主要影响因素以及固定化酶和游离酶的一些酶学性质进行了研究,并得到了较好的结果,主要研究内容如下：1.以聚丙烯腈树脂微球为母体,四乙烯五胺和氨基葡萄糖作为柔性功能基,通过化学改性的方法,合成了两种具有不同功能基的新型柔性树脂载体(PAN-TEPA和PAN-GA)。探讨了反应溶剂、反应温度、反应物质量比和反应时间对树脂增重率的影响,确定了合成反应的最佳工艺条件。应用元素分析(EA)、红外光谱(FT-IR)、热重(TGA)等分析手段,对合成树脂结构进行了表征。推断柔性树脂载体的合成路径为柔性功能基中的氨基通过与聚丙烯腈微球中的氰基发生亲核加成反应而接枝到聚丙烯腈母体上,该反应原子利用率高,较好的体现了绿色化学的特征。2.以合成的两种新型柔性树脂(PAN-TEPA和PAN-GA)为载体,木瓜蛋白酶为模拟生物蛋白分子,进行固定化工艺条件的探索。通过单因素试验,研究了载体活化条件、固定化pH、给酶量、固定化温度以及固定化时间对木瓜蛋白酶固定化效果的影响。在单因素基础上,采用响应面分析法(RSM)对酶固定化工艺条件进行了进一步的优化,得到固定化酶制备的最佳工艺。PAN-TEPA载体：固定化pH6.7,加酶量1.0mg/10.0mg,固定化温度31℃；PAN-GA载体：固定化pH7.3,加酶量1.47mg/10.0mg,固定化温度31℃。在最佳优化条件下,PAN-TEPA、PAN-GA固定化酶活力分别为4.745U/mg和5.855U/mg,酶蛋白固载量分别为56.7mg/g和72.9mg/g,酶活力回收率达到了71.3%和80.6%。说明PAN-TEPA、PAN-GA作为酶的固定化载体具有潜在的应用价值。3.以酪蛋白为催化反应底物,通过游离酶和固定化酶的酶学性质实验,考察了木瓜蛋白酶经载体固定化后对酶催化活性的影响,为实际应用提供一些理论依据。结果表明：两种载体(PAN-TEPA和PAN-GA)固定化木瓜蛋白酶后,酶最适反应温度由50℃提高到60℃,且固定化酶在50℃～80℃范围内都保持了较高的酶活力。游离酶和固定化酶的最适pH值分别为6.5和7,且酶活最适pH范围从pH6-7延伸为pH5-9,增加了酶催化反应pH的波动范围。固定化酶的动力学米氏常数Km值有所减小,说明木瓜蛋白酶经载体固定化后对底物酪蛋白的亲和力增加。酶在固定化后的失活半衰期t1/2显著延长,从4.9d(游离酶)延长到28.4d(PAN-TEPA):和26.7d(PAN-GA).固定化酶的热稳定性、贮藏稳定性和对有机溶剂的耐受性都明显高于游离酶。固定化酶还具有重复使用稳定性,在循环使用8次后,仍能保持60%以上的活性。本课题采用的新型柔性树脂载体和固定化方法为木瓜蛋白酶提供了一种友好的微环境,能够较好的保持酶蛋白分子的生物活性及催化活性,具有一定的应用价值。
【作者】贾倩；
【导师】熊春华；
【作者基本信息】浙江工商大学，食品科学与工程，2014，硕士
【关键词】固定化酶；聚丙烯腈；柔性固定化；木瓜蛋白酶；酶活力；

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