鮸鱼（Miichthys miiuy）自然杀伤细胞增强因子基因克隆及表达分析

【摘要】自然杀伤细胞增强因子（Naturalkillerenhancingfactor,NKEF）于1993年在人类的红细胞中被分离纯化，成为了Peroxiredoxin(Prx)抗氧化蛋白家族一个重要的成员。因为在体外可以增强自然杀伤细胞对肿瘤细胞的细胞毒效应，所以被命名为自然杀伤细胞增强因子。为了研究硬骨鱼中NKEF的免疫防御机制，在本篇论文中，我们采用快速扩增cDNA末端（rapidamplificationofcDNAends,RACE）的方法，经过凝胶回收、连接、转化、阳性克隆子的检测和测序后，得到鮸鱼NKEF-A全长cDNA序列。鮸鱼NKEF-AcDNA全长为1235bp，其中包括47bp的5’非翻译区，597bp的开放阅读框和591bp的3’非翻译区，整个开放阅读框编码198个氨基酸。鮸鱼NKEF-A的蛋白分子量约为23kDa，在其蛋白质序列中，含有三个半胱氨酸残基（Cys），其中第52位和173位上的半胱氨酸残基分别存在于两个高度保守的VCP信号上，通过比对其他几种I类抗氧化蛋白家族成员后，发现这两个位置的半胱氨酸残基也是非常保守的，并且是Prx家族蛋白发挥其生物学功能的氨基酸区域。荧光定量PCR数据分析后表明，NKEF-A基因在鮸鱼十个正常组织中普遍表达，但是表达水平有着明显的差异。在不同时间段鳗弧菌感染的肝组织、脾组织和肾组织中，NKEF-A的表达水平均有所上调。最后，我们构建了重组表达载体pET-NKEF质粒，诱导重组质粒表达，确定最佳的诱导时间以及诱导浓度，纯化了重组蛋白。随后将纯化后的重组蛋白制备多克隆抗体，最后Westernblot测试分析显示制备的NKEF血清蛋白可以特异地识别重组蛋白。
【作者】孟繁蔷；
【导师】徐田军；
【作者基本信息】浙江海洋学院，海洋生物学，2014，硕士
【关键词】鮸鱼；自然杀伤细胞增强因子（NKEF）；表达模式；蛋白质印迹（Westernblot）；

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