澳洲棉与亚洲棉种子萌发期转录组测序及其差异表达分析

【摘要】棉花是重要的经济作物,其天然纤维的价值已经得到广泛的认可和利用,棉纤维作为世界纺织工业最主要的天然纤维原料的地位不可动摇。同时,棉花也是重要的油料作物,棉籽仁的含油量可达45%左右,且籽仁蛋白含量也非常高。棉籽作为榨油来源、蛋白质供给及饲料和食品,具有广阔的商业前景。唯一限制棉籽得到大规模利用的是存在棉籽中的棉酚毒素。棉酚对人及单胃动物有毒,长期服用会对健康产生严重影响。部分澳洲野生棉种具有一种“子叶色素腺体延缓形成”的性状,在这些棉种的休眠种子中不含腺体和棉酚,只有当种子吸胀萌发后,腺体和棉酚才陆续形成。这为低(无)酚棉育种带来了新的思路,甚至有可能从根本上解决棉籽大范围利用的命题。本实验以二倍体野生棉种澳洲棉和二倍体亚洲棉种江陵中棉为研究对象,选取了两棉种种子在萌发时期的三个不同阶段,利用第二代高通量测序仪IlluminaHiSeq2000对其进行转录组测序。通过对测序原始数据进行预处理后,原始序列用TopHat2回贴到已经公布的D染色体组雷蒙德氏棉基因组图谱上,并根据有参考基因组的方法进行了初步分析,结果表明,由于染色体组之间存在的差异较大,序列回贴率不高,如果采取这种方法进行具体分析,有可能会丢失A染色体组和G染色体组特有的序列信息。故转而利用无参考基因组的分析方法进行继续分析。为了对两套不同染色体组进行全面分析,同时又要进行差异比较的双重目的,我们利用denovo从头拼接的方法,对A染色组、G染色体组以及A和G数据相结合的三套数据类型进行了转录组组装,分别得到226,184,213,257,275,434条转录本,为了去除转录组拼接产生的冗余及简化分析的目的,利用Perl语言对拼得的转录本进行精简提炼,最终得到了由61,048,47,908,72,985条转录本序列构成的三套转录组unigene集,其N50分别达到1,710bp,1,544bp,1,743bp。利用BLASTx和BLASTn注释原理,下载了三个公共蛋白数据库,分别是Uniprot/Swissprot.Uniprot/TrEMBL、NCBI-RefSeq(Plant),同时结合已经释放的D组雷蒙德氏棉序列预测基因及蛋白信息,对三套转录组unigene进行了全面BLAST注释,分别得到21,987,17,209,25,325条有BLAST结果的序列。进一步通过GO功能分类分析,分别得到18,766,14,552,21,374条有GO功能分类的序列。差异分析结果得到13,884个unigene在种子萌发过程中差异表达,通过对差异基因的表达模式聚类分析,结合GO富集分析,发现差异基因主要富集在次生代谢、催化结合、脂质代谢和碳水化合物代谢等方面。其中,我们发现,在与棉酚合成密切相关的萜类化合物代谢通路中,所有萜类合成的上游途径,即甲羟戊酸途径(MVA)和脱氧木酮糖磷酸/2C-甲基-4-磷酸-D-赤藓糖醇(DOXP/MEP)途径中大部分基因在澳洲棉和亚洲棉种子萌发阶段呈现截然相反的表达趋势,具体表现为在澳洲棉中上调表达而在亚洲棉中下调表达。为了进一步研究与腺体可能相关的转录因子,我们利用海1显性无腺体基因已经公布的精细定位结果,在D组雷蒙德氏棉序列中提取标记NAU2251和CIR362之间的序列并对其进行ORF预测,共得到137个ORF,对其进行BLAST注释,发现可能存在的转录因子29个,其中23个在转录组测序数据中具备同源序列。由于萜类合酶(TPS)在棉花次生代谢中起着至关重要的作用,并且鲜有除杜松烯合酶以外的其他棉花萜类合酶的报道,我们立足于D组公布的基因组信息,利用萜类合酶在Pfam平台的两个保守结构域种子文件PF01397和PF03936对D组公布的蛋白序列进行检索,共发现81个TPS相关序列。利用相同的方法对转录组unigene进行预测,得到12(A组)和9(G组)条TPS相关序列,同时下载了其他植物中报道的TPS基因序列,共198条序列进行了系统进化分析,并对棉花中TPS的亚家族进行全面的分类,结果发现除了裸子植物特有亚家族TPS-d外,其余亚家族均有序列分布。利用实时荧光定量PCR对转录组测序数据进行验证,结果显示高度的一致性。同时对澳洲棉和江陵中棉转录组中表达量最高的萜类合酶进行了组织特异表达研究,发现其在根部高表达,而在叶、茎、10DPA胚珠中表达量很低或不表达。本实验应用第二代高通量测序技术对澳洲野生棉种进行转录组高通量测序,以澳洲棉特殊腺体发育模式为研究对象,通过比较基因组学分析方法和系统的转录组分析手段,对A染色体组江陵中棉和G染色体组澳洲棉种子萌发时期的转录水平调控做了详细的阐述。该结果为研究棉花棉酚的合成及腺体的发育提供了有力的数据基础和证据。同时丰富了棉花的转录组测序信息量,对A染色体基因组序列和四倍体栽培棉基因组序列的拼接有辅助意义。
【作者】陶涛；
【导师】周宝良；
【作者基本信息】南京农业大学，作物遗传育种，2013，硕士
【关键词】澳洲棉；亚洲棉；腺体；棉酚；种子萌发；转录组测序；萜类合酶；

【参考文献】
[1]刘晓妍.大连市商业银行系统个人信用评估体系研究[D].大连理工大学,工商管理,2004,硕士.
[2]冯玉才,宋恩民,刘宏,孙小薇,韩力.地图自动化识别系统中识别车站标记的环界算法[J].自动化学报,1996,06:758-760.
[3]游永海.乳制品双渠道供应链协调机制研究[D].北京交通大学,2014.
[4]王新民,邵贝恩.ETM数据的几何校正[J].自动化学报,1994,04:452-458.
[5]杨哲.TK6920数控铣镗床滑枕动力学分析研究[D].湖北工业大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[6]严星刚,张嗣瀛.一类非线性相似组合大系统的迭代学习控制[J].控制与决策,1998,03:62-65+70.
[7]陈娟.面部表情识别研究[D].西安科技大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[8]徐芳.XXX软件公司质量管理体系建设的研究[D].吉林大学,工商管理,2012,硕士.
[9]刘光耀.商品房预售合同研究[D].吉林大学,法律,2004,硕士.
[10]李福天.液态喷射泵汽蚀流量比的质疑与验证[J].舰船科学技术.1992(05)
[11]苏斌.鼓浪屿的文化传承危机与对策[D].华侨大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[12]黄莺.基于视觉分析的疲劳检测方法研究[D].浙江工业大学,计算机技术,2012,硕士.
[13]郭莉.两周金文副词初探[D].华南师范大学,汉语言文字学,2004,硕士.
[14]冯宇坤.公民劳动权的国家保障义务研究[D].大连海事大学,法学,2013,硕士.
[15]钟惟娜.超声检查在非整倍体异常胎儿诊断中的价值[D].南京医科大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[16]石倩.铌酸钾钠—铁酸钴陶瓷的磁电耦合性能的研究[D].哈尔滨工业大学,光学,2014,硕士.
[17]吴瑞军.马克思主义和谐社会理论中国化及当代价值研究[D].山西师范大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[18]付茜茹.论破产重整制度[D].对外经济贸易大学,法律,2004,硕士.
[19]何波.基于数据挖掘的Web个性化信息推荐研究[D].西南师范大学,2003.
[20]吴惠玲.泻南补北法治疗心肾不交型失眠症的临床研究[D].广州中医药大学,针灸推拿学,2013,硕士.
[21]王春晓.现代汉字合体字研究[D].西南大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[22]李小雪.马里奥·巴尔加斯·略萨小说中女性形象研究[D].山西师范大学,比较文学与世界文学,2014,硕士.
[23]薛龙兆.基于FPGA的全景成像设计与实现研究[D].南京理工大学,物理电子学,2013,硕士.
[24]何佳玲.王宁两首复风格作品对位技法研究[D].中国音乐学院,作曲技术理论,2012,硕士.
[25]李艳慧,刘中山,赵建华,赵宝,戴宪起.Al,Si,P掺杂对Ge在石墨烯上吸附的影响[J].河南师范大学学报(自然科学版),2011,05:51-54.
[26]杨译.历史课本剧在初中历史教学中的应用[D].东北师范大学,教育（专业学位）,2012,硕士.
[27]项永丹.在城市建设中融入智力财富[J].今日浙江,2013,22:25.
[28]王文军.新世纪以来澳大利亚的中国观研究[D].吉林大学,国际政治,2014,硕士.
[29]于实.用于CNI综合射频前端的电调谐滤波器的研制[D].电子科技大学,电磁场与微波技术,2013,硕士.
[30]李佳.~(18)F -FDG PET/CT在非霍奇金淋巴瘤诊断及治疗中的意义[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[31]季蒙.内蒙古和谐矿区建设和管理探讨[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[32]白国宏.诺贝尔奖得主原来是这样的?[J].人事天地,2010,23:64.
[33]李慧.热休克蛋白90α在HBV相关性肝细胞癌中的表达及临床意义[D].广州医科大学,传染病学,2014,硕士.
[34]张娇.江苏省五一、十一重要节假日天气异常特征及成因分析[D].南京气象学院,气象学,2004,硕士.
[35]王志坚.虹膜识别技术与实现[D].内蒙古大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[36]张伦庆.某GPS转发外测系统标校方法的改进[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2011,硕士.
[37]曹晨.新形势下苏中地区新型农民培育问题研究[D].苏州大学,思想政治教育,2012,硕士.
[38]田原.市场拓展、产业转移与区域产业结构优化[J].现代管理科学,2015,02:88-90.
[39]冯励.抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备以及初步应用研究[D].广西大学,预防兽医学,2004,硕士.
[40]朱莉莉.鄂西地区农村中小学体育场地现状分析与发展研究[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[41]张磊.基于特征学习的双站高频地波雷达一阶海杂波检测技术研究[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[42]孙梦丹.内部控制质量与企业融资成本的关系研究[D].苏州大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[43]张青,张志,方志雄.线性回归技术在企业设备管理中的应用[J].江西电力职业技术学院学报,2005,03:94-95.
[44]闫相如.固定化大肠杆菌和毕赤酵母菌二元体系发酵产S-腺苷甲硫氨酸的研究[D].江西农业大学,微生物,2012,硕士.
[45]翟晓彤.第二类B-样条权函数神经网络灵敏度研究、算法实现及其应用[D].南京邮电大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[46]林涛.论网络媒体的议程设置功能[D].北京印刷学院,传播学,2004,硕士.
[47]梁锋.硅纳米线和多孔硅的制备及表面修饰研究[D].浙江大学,材料工程,2014,硕士.
[48]张新良,谭永红.基于输入空间扩张的动态迟滞神经网络模型[J].自动化学报,2009,03:319-323.
[49]孙晓明,王玮,苏粟,姜久春,徐丽杰,何宣虎.基于分时电价的电动汽车有序充电控制策略设计[J].电力系统自动化,2013,01:191-195.
[50]董选明,谭民.质量弹簧系统的重构和容错控制研究[J].控制与决策,2000,01:46-50.