鹦鹉热衣原体Taqman实时荧光PCR检测方法的建立

【摘要】鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci,Cps)属于衣原体科,嗜性衣原体属,生物学特性介于细菌与病毒之间,具有严格的胞内寄生性,革兰氏染色呈阴性。鹦鹉热衣原体病是由Cps引起的一种人畜共患病,在猪、牛、羊和马等牧畜主要表现为流产,死产,食欲废绝,咳嗽,腹泻等症状；鸽子、火鸡等禽类表现为肺炎、呼吸困难、精神沉郁、死亡等病症；在人则以鸟疫和Reiter综合征为主。鹦鹉热衣原体具有宿主广泛,传播途径复杂等特点,在全球许多国家和地区都有发现,并且随着动物的流动,宠物鸟饲养的增多,鹦鹉热衣原体病不仅没有得到有效控制,反而呈现逐年上升趋势。国内外有关感染Cps病例的报道也是日渐增多。感染鹦鹉热衣原体引起的症状与感染其他衣原体引起的症状差异并不是十分明显,在临床上,快速、准确地诊断该病比较困难。因此建立一套快速准确的诊断方法十分必要。Taqman实时荧光PCR技术是一项比较新的技术,具有快速、灵敏、准确、以及定量等特点,其在Cps预防控制、快速检测与诊断方面都具有重要意义。根据GenBank上已公布的衣原体16S-23SrRNA和MOMP基因序列分别设计Y1和Y2、Y3Taqman实时荧光PCR与C1和C2检测用常规PCR。根据以上两个目的基因分别设计X1和X2测序用常规PCR。以鹦鹉热衣原体阳性核酸与水为对照进行试验,结果显示：Y1和Y2检测曲线优于Y3检测曲线。经反应条件与体系优化,对鹦鹉热衣原体与猪鼻支原体、肺炎支原体、鸡滑液囊支原体、鸡毒支原体等4支原体,以及大肠埃希氏菌、痢疾志贺氏菌、沙门氏菌、金色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、霍乱弧菌、副溶血型弧菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、甲型溶血型链球菌、阪崎氏肠杆菌等11种细菌进行对比扩增试验,发现两套Taqman实时荧光PCR具有良好的特异性；双链DNA灵敏度检测结果显示：Y1和Y2实时荧光PCR的检测下限分别是7个拷贝和2个拷贝的双链DNA,比检测用常规PCR灵敏度分别高130倍和5000倍。衣原体基因组灵敏度检测结果显示：Y1和Y2实时荧光PCR比检测用常规PCR灵敏度均高1000倍。由此证明两套Taqman实时荧光PCR灵敏度比常规PCR高。X1和X2测序用常规PCR扩增三株Taqman实时荧光定量PCR检测呈阳性的鹦鹉热衣原体,产物经DNA测序比对,结果显示该三个样品是鹦鹉热衣原体。此结果证明建立的Y1和Y2Taqman实时荧光PCR检测方法具有快速、高效、特异和灵敏的特点,可用于鹦鹉热衣原体样品的检测。
【作者】王建忠；
【导师】姚火春；张常印；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】鹦鹉热衣原体；TaqMan实时荧光PCR；PCR；检测；

【参考文献】
[1]靳其兵,王建辉,顾树生.多步预测性能指标函数下的神经网络逆动态控制方法[J].控制与决策,1999,04:21-26.
[2]张卫亮.青藏地区冷补沥青混合料多功能养护设备设计与研究[D].长安大学,机械电子工程,2013,硕士.
[3]郭晓霞.“维纳斯”的形象设计与审美观念[D].山东师范大学,美术学,2013,硕士.
[4]刘子钰.信誉与商事法律[D].吉林大学,法学理论,2014,硕士.
[5]吴斌,陈明生,秦成,于杰.进口饲料中沙门氏菌的分离与鉴定[J].饲料工业.2003(11)
[6]刘誉华.加味黄芪建中汤治疗复发性口腔溃疡（脾肾阳虚证）的临床疗效观察[D].成都中医药大学,中医内科学,2012,硕士.
[7]秦晓峰.北武夷地区燕山期与成矿有关的火山—侵入岩浆序列初步框架[D].中国地质大学（北京）,矿物学、岩石学、矿床学,2014,硕士.
[8]马金春.6016大功率柴油机的开发[D].山东大学,动力工程（专业学位）,2012,硕士.
[9]杨小军,邢科义,施坤林,潘泉.传感器网络下机动目标动态协同跟踪算法[J].自动化学报,2007,10:1029-1035.
[10]王尧.关于格式合同的法经济学分析[D].河北经贸大学,民商法,2012,硕士.
[11]朱鹏.HDAC抑制剂诱导胆管癌细胞凋亡过程中aPKC_ι表达的变化[D].华中科技大学,外科学,2013,硕士.
[12]吴杰雨.基于可拓实例推理的智能化概念设计研究[D].浙江工业大学,2003.
[13]吴罡.西门子工业电源中国市场营销策略研究[D].中国地质大学（北京）,工商管理,2013,硕士.
[14]陈霓.涉众型经济犯罪的成因及防控[D].大连海事大学,法律,2012,硕士.
[15]浪潮齐鲁软件CEO王柏华.发展软件产业参与国际竞争[N].中国电子报,2001-10-09016.
[16]陈静丽.高速公路应急救援能力评价系统研究[D].长安大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[17]张锦松.债务重组盈余管理及其内部控制自我评价研究[D].天津财经大学,会计学,2012,硕士.
[18]尚辰蔚.典型草原牧户禀赋分异及其社会—经济—生态的分析[D].内蒙古大学,生态学,2014,硕士.
[19]陈一.中国传统视觉元素在网络游戏界面设计中的运用研究[D].江南大学,设计艺术学,2012,硕士.
[20]周晓敏.孔孟荀贤能政治思想评述[D].西北大学,中国史,2014,硕士.
[21]宋璠.金属氧化物避雷器在线监测技术研究[D].哈尔滨理工大学,高电压与绝缘技术,2012,硕士.
[22]吴军,孙丛梅.数据挖掘技术在Web中的应用[J].内蒙古科技与经济,2004,S2:86-88.
[23]尹格.利用磁力显微镜图像计算杂散场和分析磁畴结构[D].兰州大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[24]张朋松,袁伦渠.中国企业培训路径演进的实证[J].统计与决策,2014,12:174-177.
[25]李琳.先导式形式聚焦教学法在中国初中年级英语语法教学中的使用[D].首都师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[26]霍建杰.非球面玻璃透镜模压成型应力状态及成型形状的数值模拟与仿真[D].湖南大学,机械工程,2011,硕士.
[27]罗云钢.汽车12V起停系统若干关键技术研究[D].东华大学,机械工程（专业学位）,2014,硕士.
[28]杜雅哲.急性髓系白血病诱导治疗第7天外周血白血病细胞残留与疗效的相关性分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[29]杨继业.三层体系结构数据仓库的工程化研究[D].上海海运学院,2002.
[30]隋永帅.组合预测技术在财务业绩预测中的应用研究[D].山东财经大学,会计学,2014,硕士.
[31]张海燕.基于BIM的建设领域文本信息管理研究[D].大连理工大学,土木工程管理,2013,硕士.
[32]白兆帅.亚硒酸钠对高脂型2型糖尿病小鼠胰岛素信号通路的影响及其机制[D].华中科技大学,无机化学,2013,硕士.
[33]赵媛.丹皮酚对局灶性脑缺血的保护作用及对pAkt、Nrf2和HO-1调节作用的实验研究[D].河北医科大学,神经病学（专业学位）,2013,硕士.
[34]李荣风.自我概念、母亲抑郁与青少年焦虑/抑郁之间的关系[D].山东师范大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[35]刘娟.紫薇专类园规划与设计研究[D].中南林业科技大学,园林植物与观赏园艺,2014,硕士.
[36]金路.基于政府视觉的技能人才培养问题研究[D].云南财经大学,公共管理,2013,硕士.
[37]何秀兰.基于SI-ATRP咪唑阳离子功能化CNTs传感器的研究[D].湘潭大学,2014.
[38]谢珂,谢震林.徽州古民居内部空间秩序的社会文化观念形态体现[J].工业建筑,2014,05:1.
[39]付娟.浮点处理单元结构和算法研究[D].西北工业大学,计算机系统结构,2004,硕士.
[40]徐广.我国中小企业信贷违约风险研究[D].西南大学,金融学,2013,硕士.
[41]程永超.坎普法视野中的元禄日本[D].山东大学,日语语言文学,2013,硕士.
[42]夏支文,杨英,井云环.干煤粉气化合成气洗涤系统技术改造[J].当代化工,2014,11:2314-2315+2318.
[43]孙海燕.从《中国时报》广告审视台湾社会消费文化的变迁-1988到2012年[D].华南理工大学,传播学,2014,硕士.
[44]鲁国鹏.基于JPEG图像的信息隐藏算法研究[D].杭州电子科技大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[45]刘国华.基于压缩传感的无线传感器网络低能耗研究[D].南京邮电大学,仪器仪表工程（专业学位）,2013,硕士.
[46]吴波.混合密母算法及其在变化检测中的应用[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[47]缪昭华.光/声/磁一体化多功能造影剂的制备和性能研究[D].哈尔滨工业大学,生物医学工程,2013,硕士.
[48]刘永平.我国应对贸易救济调查中价格可比性问题研究[J].价格理论与实践,2014,07:109-111.
[49]白海灵.交互白板环境下师生交互行为个案研究[D].华中师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[50]吴旻.和谐社会构建背景下大学生就业问题研究[D].东北师范大学,思想政治教育,2012,硕士.