鸭疫里氏杆菌保护性抗原的筛选及应用

【摘要】鸭疫里氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA),原名鸭疫巴氏杆菌(PasteurellaAnatipestifer,PA),原为巴氏杆菌科里氏杆菌属的一员,后被划入黄杆菌科,除了进化上的特异性,另一个引起人们研究兴趣的原因主要是该菌引起世界范围内雏鸭的一种重要传染病——鸭传染性浆膜炎。该病原菌主要引起雏鸭败血症,表现为脑膜炎、心包炎和腹膜炎等,导致养鸭业巨大经济损失。目前,已鉴定出的21种血清型,各血清型之间缺乏交叉保护力是阻碍该病防控、疫苗研究和鉴别诊断的主要因素。市场上尚无安全、高效的疫苗用于该病原菌的防控。新型保护性抗原,特别是能为不同血清型菌株感染提供交叉保护力的交叉保护性抗原的筛选是研制新型亚单位疫苗的当务之急。2011年以来已有数株鸭疫里氏杆菌基因组被公布,这些基因组信息为高通量筛选保护性抗原开辟了新途径。根据以往的报道和本实验室分离保存的菌株统计,鸭疫里氏杆菌2型是临床感染中危害最大的血清型之一,我们选择2型代表毒株RAf153进行全基因测序,并建立了鸭疫里氏杆菌RAf153全菌蛋白的免疫蛋白质组学方法,用该方法共筛选到12种保护性抗原候选因子。假定用一种血清型毒株人工感染雏鸭后制备的康复血清中存在其他血清型菌株抗原蛋白相应的抗体,我们用抗RAf153鸭康复血清鸭疫里氏杆菌1型代表毒株RAf63及2型代表毒株RAf153的全菌蛋白和分泌蛋白进行免疫蛋白质组学筛选,经过质谱鉴定和肽指纹图谱分析,最终筛选到16种RAf63的免疫反应性蛋白和28种RAf153的免疫反应性蛋白,经过比对分析,我们从中筛选到6种共同抗原,这些蛋白可作为交叉保护性抗原候选因子。对这些蛋白进行原核表达,并再次用抗RAf153鸭康复血清对融合蛋白进行免疫反应性分析,最终成功筛选到3种具有免疫反应性的融合蛋白,用这3种蛋白进行雏鸭攻毒保护试验,结果显示CR4(OmpA)对同源毒株及异源毒株感染均具有良好的保护力。免疫保守性分析结果显示CRl可与1、2、10和13型血清发生免疫反应,CR4与所有血清型均发生免疫反应,CR5可与1、2、10型血清发生免疫反应。这些特异性蛋白对于鸭疫里氏杆菌的流行病学分析具有重要意义。目前仍缺乏简便高效的检测方法用于鸭疫里氏杆菌不同血清型尤其是某些特定血清型菌株感染的检测,本研究中利用筛选到的免疫保守性很好的外膜蛋白A(OmpA)和延伸因子G(EfG)初步建立起ELISA检测方法。对收集到的465份出栏前鸭血清和30份种鹅血清进行抗体检测,结果显示,南京周边地区雏鸭血清OmpA抗体阳性率为48.8%,种鹅为33.3%；其中1、2、10型占79.3%。利用GenBank上公布的16SrRNA基因信息设计引物建立起PCR检测方法,从一个1万羽养殖规模的鸭场随机抽取10只表观健康的出栏前肉鸭采集喉拭子进行PCR检测,从中检出5个阳性结果；从另一万羽鸭场收集10只比同龄鸭个体小、离群、腹泻、精神萎靡、共济失调的出栏前肉鸭,剖检可见肝脏有出血点、心包纤维素性渗出,严重者内脏与腹腔壁发生粘连,从脑部分离病原进行烛缸培养,共分离出2株鸭疫里氏杆菌,其中一株与大肠杆菌混合感染,两株菌用玻片凝集试验鉴定为2型菌株。说明南京周边地区鸭场已呈现广泛带菌状态。对RAf153进行全基因组测序(未公布),将其与已公布的1型菌株进行比对后共筛选到长度为200bp-3000bp的特有片段共16处,选择其中7处设计引物进行型特异性鉴定,大部分引物可以区分1型和2型菌株,但是所有引物均能从本实验室保存的其他血清型菌株中扩增出目的片段,因此尚无法用于鉴别诊断。引物7扩增的片段位于编码免疫反应性蛋白G0121(GenBankaccessionNo.KC905110)基因的ORF内。Blast分析结果显示,该段基因与其它所有已公布序列均无任何同源性。该蛋白将有望作为2型菌株特有的免疫原性蛋白用于型特异性ELISA方法的建立。
【作者】翟志鹏；
【导师】张炜；张振岚；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】鸭疫里氏杆菌；免疫蛋白质组学；保护性抗原；PCR检测；ELISA检测；

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