广东TTSuV_s流行病学调查与TTSuV_2 ORF1抗原性分析

【摘要】输血传播病毒(Transfusiontransmittedvirus,TTV)是一种小的,无囊膜的,单股环状负链的人畜共患DNA病毒,TTV的发现是于1997年底由NiShizawa运用代表性差异分析技术(Representationaldifferenceanalysis)从一名非甲一庚型肝炎病人的血清中克隆得到的病毒DNA片段,随后,人们在非灵长类以及猪、牛、羊、犬,猫、家禽等多种家养及野生动物体内也发现了TTV的感染。猪源TTV(TTSuVs)在世界范围内广泛检出,引起人们的极大关注。目前TTSuVs的诊断主要依赖DNA的检测,由于猪源TTV具有潜在的危害,因此对其抗原性进行分析是非常必要的。本实验利用基因重组技术将TTSuV2ORF2基因克隆至原核表达系统中,制备获得了具有生物学活性的重组Cap蛋白,并进行了免疫原性研究,主要研究内容如下：1、为了解广东省猪群中猪输血传播病毒(TTSuVs)的感染情况,本研究采用Nest-PCR方法对广东省7个不同地区规模化猪场抽检采集的159份育肥猪血清进行检测。结果表明,TTSuVs的两个种TTSuV1和TTSuV26(?)阳性检出率分别为54.72%和35.22%,二者的共感染率为29.56%,说明TTSuVs在广东猪群中有较为广泛的传播。挑选Nest-PCR检测TTSuV1和TTSuV2为阳性的样品,分别在病毒保守区设计引物,扩增病毒基因,并对比分析通过PCR扩增获得的TTSuVs结构蛋白编码区ORF1与NCBI上其它已发表的不同属种TTVsORF1序列的进化关系和同源性。结果表明猪TTV与人、犬、猫、猴的TTVs处在进化树的不同分枝,具有很大差异；本次研究获得的TTSuV1ORF1序列与国内多株已发表的TTSuV1ORF1序列同源性为72%-75%；获得的TTSuV2ORF1序列与现有测序的多株TTSuV2的ORF1序列同源性为88%-97%。2、以本实验室保存的TTSuV2-GDIMA1为模板设计引物,进行ORF1序列的PCR扩增、克隆及测序。通过对TTSuV2ORF1蛋白的抗原性,信号肽,跨膜区,亲疏水性和二级结构进行预测分析,将TTSuV2ORF1截短成VP1、VP2两个片段,分别将这两片段连入pET-21b载体并通过大肠杆菌系统进行表达。通过蛋白纯化,切胶回收获得高纯度的目的蛋白。以获得的高纯度ORF1-VP1与ORF1-VP2蛋白为抗原,以血清样品中经Nest-PCR检测TTSuV2呈阳性的样品进行WesternBlot检测。结果显示ORF1-VP1与ORF1-VP2的表达产物均为包涵体。WesternBlot结果证实,猪对TTSuV2的感染的确产生了抗TTSuV2ORF1的IgG抗体,且两段蛋白均具有抗原性。本研究对TTSuV2ORF1蛋白的生物信息学特性进行了一定的探索,有利于监测TTSuV2的进化情况,为深入研究该病毒的遗传变异和蛋白质功能奠定一定的生物学基础。3、为了分析和筛选TTSuV2ORF1抗原性较好的区域,本试验将通过大肠杆菌表达系统表达出的TTSuV2ORF1-VP1和VP2重组蛋白纯化后作为间接ELISA检测方法的抗原,与Nest-PCR共同检测213份猪血清中抗TTSuV2的IgG抗体和病毒DNA。结果显示Nest-PCR检测呈阴性的部分样本,通过血清学检测呈现出较高抗体水平；而Nest-PCR检测呈阳性的部分血清样品,其抗体水平却相对较低。TTSuV2ORF1-VP1蛋白和VP2蛋白均具有良好反应原性,实验结果预示其中可能存在中和位点。用商品化的ELISA试剂盒检测相同血清中CSFV、PRRSV、PRV、HCV的阳性率分别为84.44%、86.22%、45.33%、68.42%。本试验为进一步研究TTSuV2ORF1抗原表位奠定了基础。
【作者】陈轶雯；
【导师】王贵平；姚火春；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】TTSuV1；TTSuV2；流行病学；蛋白表达；抗原性；分析；间接ELISA检测；抗原表位；

【参考文献】
[1]章燕.高中生生物实验设计能力现状及培养策略[D].湖南师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[2]于乐.补肾活血法治疗肾虚血瘀型股骨头坏死的临床研究[D].北京中医药大学,中医学,2013,硕士.
[3]聂玲丽.磺化聚醚醚酮/磷酸改性粒子复合膜制备与质子传递强化[D].天津大学,化学工艺,2013,硕士.
[4]王翠玲.某三级医院输尿管结石住院患者临床路径制订及其实施效果评价研究[D].山东大学,社会医学与卫生事业管理,2012,硕士.
[5]冯宜彬.Lp-空间中对凸体的若干问题研究[D].三峡大学,应用数学,2014,硕士.
[6]王胜辉.抛丸器耐磨件的复合型壳熔模铸造工艺与设备研究[D].济南大学,机械工程,2012,硕士.
[7]刘杰.秦皇岛市康泰医学系统有限公司业务流程再造研究[D].燕山大学,工商管理,2014,硕士.
[8]姜欣.从隋唐石窟看禅宗美学对现代服装的影响[D].长春工业大学,设计艺术学,2013,硕士.
[9]李瑞峰.2010西安曲江—澳大利亚电影周采访交替传译实践报告[D].西安外国语大学,翻译,2013,硕士.
[10]曾辉.浙江省居住建筑节能技术经济评价体系研究[D].浙江大学,2008.
[11]贾显乐.金属掺杂碳纳米管电极应用于微生物燃料电池处理废水研究[D].扬州大学,环境科学,2012,硕士.
[12]李保良.船舶快速搭载中控制分段弹性变形的研究与应用[D].江苏科技大学,船舶与海洋工程（专业学位）,2014,硕士.
[13]赵杰琼.铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统调控基因的研究[D].西北大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[14]陈剑.安徽省政府投资项目管理研究[D].安徽大学,工商管理,2013,硕士.
[15]凌瑜璐.文化视野下的城市化[D].中国艺术研究院,艺术学,2012,硕士.
[16]王敏娴.乡村旅游社区参与机制研究[D].浙江大学,2004.
[17]张明宇.基于城乡一体化的水污染防治规划评价[D].河南农业大学,农业资源利用,2012,硕士.
[18]张建平,朱忠烈,柳璐,田书欣,张立波,程浩忠.大规模风电接入的输电系统价值规划方法[J].电力系统自动化,2014,19:47-51.
[19]任楠楠.离子液体体系密度、粘度及表面张力的测定及研究[D].北京化工大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[20]李平.不同深低温冷冻条件对异种移植骨免疫原性影响的实验研究[D].遵义医学院,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[21]刘志平.构棘中黄酮类化合物的分离表征和二氢黄酮肟类、腙类衍生物的合成及活性研究[D].广西大学,化学工艺,2013,博士.
[22]杨倩.当代高中学生法治意识存在的问题及对策研究[D].华中师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[23]刘晓.体育院校“艺术体育编导”人才培养的探索性研究[D].山东体育学院,体育教育训练学,2012,硕士.
[24]张云鹏,孙燕,陈振杰.基于多智能体的土地利用变化模拟[J].农业工程学报,2013,04:255-265+300-301.
[25]高磊.基于光流的动态场景中运动车辆检测与跟踪算法研究[D].中国科学技术大学,机械电子工程,2014,硕士.
[26]郭根材,聂磊.瑞士铁路旅客运输组织分析及启示[J].综合运输,2015,03:90-93.
[27]高涯.黄河制药公司销售模式设计[D].西南交通大学,工商管理,2003,硕士.
[28]唐虎.单桥空心橡胶弹簧复合悬架系统研究[D].西南交通大学,交通运输工程,2014,硕士.
[29]李俊清.星载激光对潜通信系统研究[J].舰船电子工程.1998(01)
[30]胡敏,潘雪增,平玲娣.基于数据挖掘的实时入侵检测技术的研究[J].计算机应用研究,2004,01:105-108.
[31]李磊.“空间语意表达”在室内设计中的应用研究[D].大连工业大学,设计艺术学,2010,硕士.
[32]孙宇.双辊薄带连铸无取向硅钢组织性能研究[D].东北大学,材料加工工程,2012,硕士.
[33]李雨珊.不同地区在职初中教师的TPACK现状调查分析与对比研究[D].华中师范大学,教育技术学,2014,硕士.
[34]吕瑜.HKD大学筹资问题研究[D].河南科技大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[35]毛亚郎孙毅计时鸣单继宏.介质球间非限制料层夹持形态研究[J].中国机械工程,2014,23:.
[36]邵鹏.基于渗透测试的跨站脚本漏洞检测研究[D].郑州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[37]陈路.重读费尔德曼对普兰丁格的知识论辩护方案的批评[D].复旦大学,外国哲学,2012,硕士.
[38]邢东东.微博社会网络中的群体分析研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[39]朱录.我国公共支出结构经济增长效应的区域差异研究[D].上海师范大学,政治经济学,2013,硕士.
[40]李艳芬,史保锋.莱钢GT078L3K3型离心式空气压缩机的防喘振控制[J].冶金自动化,1999,05:53-54.
[41]闫菲.辽宁省专科院校毕业生就业影响因素调查分析[D].大连理工大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[42]朱茹琳.基于博弈分析的既有建筑节能改造经济激励政策研究[D].中国矿业大学,工程管理,2014,硕士.
[43]贾佳.皮秒脉冲电场治疗宫颈癌动物模型的机制及有效性安全性研究[D].重庆医科大学,妇产科学,2014,博士.
[44]赵宇靖.N-V中心在量子信息处理和量子计算中应用的研究[D].湖南师范大学,原子与分子物理,2014,博士.
[45]崔银贵.谈如何提高水利施工企业的经济效益[J].河北水利.2005(10)
[46]邓一平.浅论莱布尼茨认识论对经验论的吸收[D].湖南师范大学,外国哲学,2014,硕士.
[47]马国帅,韩丹丹.电化学电容器中NiO电极材料的研究进展[J].吉林化工学院学报,2013,05:65-71.
[48]李迪敏.基于公理化设计的实验系统设计—混合驱动机械[D].华东理工大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[49]黄超.具有多维限定性约束条件的交易规则模型及采掘算法研究[D].湖南大学,2002.
[50]邓翔宇,马义德.PCNN参数自适应设定及其模型的改进[J].电子学报,2012,05:955-964.