辣椒素合成酶（CS）基因启动子的克隆及功能分析

【摘要】辣椒素是辣椒（CapsicumannuumL.）中特有的一种生物碱类植物次生代谢产物，在食品、保健、医药、农业和军事等领域发挥重要作用。目前，纯天然、无污染的辣椒素生产量远低于市场需求。提高优良辣椒品种中的辣椒素含量，既可以满足市场需求，又可提高辣椒成产的附加值，有利于国家农业产业结构调整。深入研究辣椒素生物合成关键基因的表达及调控，可为提高辣椒素的生物合成量提供技术支持，并为辣椒的定向育种提供重要的参考依据。辣椒素合成酶是辣椒素合成过程中最后一个酶，是关键的限速酶。主要定位于果实胎座表皮细胞的液泡膜上，在辣椒素的合成反应中，辣椒素合成酶首先催化支链脂肪酸与辅酶A（COA）形成isoC10-COA复合体，然后在ATP和Mg2+辅因子的作用下，isoC10-COA与香草基胺合成辣椒素。因此，研究辣椒素合成酶基因启动子对解析基因表达调控有重要意义；为分离参与辣椒素生物合成调控相关的转录因子,筛选与其互作的蛋白提供重要实验依据，对阐释辣椒素合成的转录调控机制具有重要理论意义。1.本实验利用特异性引物克隆了CS基因启动子序列，大小为1351bp。并对其进行了启动子功能元件预测。CS基因启动子序列中除了含有启动子核心序列外，还有多个与光照、水分胁迫、激素响应等相关的顺式作用元件或结合位点。有与脱落酸ABA响应相关的顺式作用元件ABRE；与损伤诱导和赤霉素GA信号传递相关的W-box单元；在干旱胁迫下的MYB结合位点；与茉莉酸甲酯响应相关的顺式作用元件；还有与花粉特异性表达元件及增强子序列GTGA-motify和多个响应光反应的作用元件等。2.本实验构建了3个5’端缺失植物表达载体，并对全长序列进行了遗传转化，得到13株T1代转基因阳性的拟南芥植株，41株T2代转基因阳性植株。对T1代转基因拟南芥植株的茎、叶、花进行GUS组织特异性染色，染色结果表明，CS基因启动子在拟南芥驱动GUS基因特异地在花药中表达，在其它组织或器官内没有检测到蓝色的GUS染色。T2代的GUS染色结果与T1代一致。基于以上结果推测CS基因启动子为花器官特异性启动子。3.为了验证启动子中顺式作用元件的活性，采用点突变的方法将启动子序列中与茉莉酸甲酯响应相关的作用元件、干旱胁迫下MYB结合位点序列进行突变并构建植物表达载体对拟南芥进行遗传转化。得到MeJA突变转基因T1代拟南芥3株，MeJA与MYB共同突变转基因T1代拟南芥2株。MeJA突变转基因T2代拟南芥43株。4.为了验证启动子中与茉莉酸甲酯响应相关的作用元件是否受茉莉酸甲酯诱导，对启动子全长以及MeJA突变拟南芥进行不同浓度的茉莉酸甲酯处理。对植株的茎叶花进行GUS染色，GUS染色结果表明，MeJA突变与未突变拟南芥花GUS染色无显著差异或者差异微弱，MeJA顺式作用元件的功能有待于进一步验证。
【作者】刘羽；
【导师】郭庆勋；
【作者基本信息】吉林大学，植物学，2014，硕士
【关键词】辣椒；辣椒素合成酶；启动子；GUS；遗传转化；

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