萝卜霜霉病抗性蛋白组学分析和抗病基因同源序列分离

【摘要】萝卜(RaphanussativusL.)是十字花科萝卜属一、二年生根菜类蔬菜作物,在我国的种植面积位居前列,是出口创汇的主要蔬菜品种。由寄生霜霉(Hyalonosporanparasitica)引起的霜霉病是十字花科作物上的一种主要病害。近几年,萝卜霜霉病的发生逐渐严重,加之病毒病的复合侵染,造成萝卜产量和品质严重下降,而此前对萝卜霜霉病的研究一直未引起育种学家的重视。植株在受到病原菌的侵染后,体内会发生一系列的变化,为了更好的了解植物的抗病机制,本研究利用双向电泳技术和mRNA差异显示技术分析萝卜叶片受霜霉菌侵染前后不同时期的蛋白质组变化和差异表达基因的表达情况；成功克隆多种抗病基因的相似序列,并发展成标记来分析不同萝卜品种的抗病性。研究结果将有助于从不同水平上分析萝卜受病原菌侵染后的抗病机理,为萝卜品质与产量的遗传改良提供一定的理论依据。主要研究结果如下：1.以感病品种’NAU-BJQ’为材料,在四叶期接种霜霉菌,用Tris-Hcl/TCA-丙酮法提取对照及处理后7d的叶片总蛋白。双向电泳后,结合PDQuest8.0软件分析和肉眼观察,发现经霜霉菌处理的萝卜叶片相对于对照有24个蛋白点表现出明显的差异,并对其进行了MALDI-TOF/TOF质谱分析。质谱鉴定结果显示,有22个差异蛋白获得成功鉴定。生物信息学分析表明,已鉴定的蛋白参与了蛋白质合成和代谢以及稳定、糖和能量代谢、信号转导、抗性与调控相关等生命活动功能。利用qRT-PCR技术对2个上调蛋白和2个下调蛋白基因的表达情况进行了分析,结果发现它们在接种后不同时期的表达水平不尽相同,但都与抗性密切相关。2.利用mRNA差异显示技术分析萝卜叶片接种霜霉菌前后不同发育时期的差异基因表达情况,用80对引物组合进行扩增。经过二次扩增验证,成功分离到56条cDNA差异片段。将差异片段回收测序,结果显示,这些差异片段分别参与了转录调控、信号转导、普通新陈代谢、转运通道、防卫与胁迫反应、蛋白质代谢等功能,表明萝卜受到病原菌后,多种代谢途径发生了变化。利用qRT-PCR技术对6条具有代表性的cDNA片段对应基因的表达情况进行了分析,发现它们的变化趋势与差异显示分析结果基本一致。3.使用两种方法进行了抗病基因同源序列的克隆：第一种方法是根据抗病基因产物的NBS保守结构域设计简并引物,用PCR方法扩增基因组DNA获得抗病基因同源序列(RGAs);第二种方法是利用抗病基因的全长序列,在萝卜EST数据库中进行检索,找到与抗病性相关的EST。通过第一种方法共得到20个与已知抗病基因有较高同源性且有连续开放阅读框的RsRGAs;利用数据库检索(datamining)的方法共得到257个抗病基因类似物。根据这些抗病基因同源序列设计特异引物,并发展成RGA标记。通过RGA标记的数据分析,32个萝卜品种在相似系数0.68水平被分为四组,且聚类结果与霜霉病人工接种鉴定结果具有很高的一致性。
【作者】王现丽；
【导师】龚义勤；柳李旺；
【作者基本信息】南京农业大学，蔬菜学，2013，硕士
【关键词】萝卜；霜霉病；蛋白质组学；mRNA差异显示技术；抗病基因同源序列；

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