马铃薯StCYP707As基因的克隆与功能分析

【摘要】马铃薯(SolariumtuberosumL.)是仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。马铃薯块茎是其繁殖、储藏和产品器官。研究马铃薯块茎形成的调控机制,不仅具有理论价值,而且对马铃薯的产量提高具有一定的指导意义。马铃薯块茎发育是一个复杂的生物学过程,并受内源以及外界因素的共同调控。外部因素包括光照、温度、氮水平等；内部因素包括光敏色素、转录因子、植物激素等。CO(CONSTANS)是植物开花诱导反应中起关键作用的转录因子。最近,我们的研究发现,在StCOL反义抑制转基因马铃薯植株中,StCYP707A基因,ABA的分解中关键酶——8’-羟化酶(8’-hydoxylase)基因,受到StCOL的调控。为了揭示StCYP707A基因在马铃薯块茎形成中的作用,本文从马铃薯克隆了StCYP707A1,StCYP707A2和StCYP707A3基因,并通过构建StCYP707A1过表达和反义抑制转基因植株,初步分析了StCYP707A1对块茎形成的作用。主要研究结果如下：1)采用RT-PCR从栽培品种马铃薯“Desiree”中克隆了StCYP707A1,该基因由6个内含子和7个外显子构成,StCYP707A1cDNA序列含有一个全长为1407bp的开放阅读框,编码一个由469个氨基酸残基构成,分子量为53417.2Da,理论等电点为8.90的蛋白。StCYP707A1含有细胞色素P450半胱氨酸亚铁血红素配体,符合P450单加氧酶家族特征。StCYP707A1与其他同源蛋白氨基酸序列比对结果表明StCYP707A1和与AtCYP707A2在同一簇上。组织表达分析显示,StCYP707A1在未处理的栽培种马铃薯根,茎和叶中均有表达,但是叶中的表达量最高。同时该基因受低温、干旱、高盐、真菌及SA诱导表达。2)使用pCAMBIA1304载体,构建了StCYP707A1基因的过表达和反义抑制载体1304-StCYP707A1、1304-StCYP707A1-F,通过农杆菌浸染法转化马铃薯,经PCR检测获得了过表达植株4株,反义抑制转基因植株9株,块茎产量分析显示,过表达转基因植株产量与对照相比有明显增加,而反义抑制转基因植株则比野生对照植株产量低。转基因株植块茎淀粉含量方面,过表达植株均高于野生对照组,反义抑制植株均低于对照植株,且差异显著。而总蛋白含量方面则差异不显著。3)采用RT-PCR从栽培品种马铃薯”Desiree”中克隆了StCYP707A2,StCYP707A2基因ORF为1425bp,编码一个由475个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白分子量为54271.9Da,理论等电点为9.31；StCYP707A2含有细胞色素P450半胱氨酸亚铁血红素配体,符合P450单加氧酶家族特征。StCYP707A2与其他同源蛋白氨基酸序列比对结果表明,StCYP707A2与SlCYP707A1关系较近。组织表达分析显示,StCYP707A2在叶中表达表达量最高,在茎中表达量较弱,在根中几乎检测不到,该基因受低温、干旱、高盐、真菌及SA诱导表达。4)采用RT-PCR从栽培品种马铃薯“Desiree”中克隆了StCYP707A3,StCYP707A3的开放阅读框为1329bp,含有5个内含子,6个外显子,编码一个由443个氨基酸残基组成,蛋白分子量为50524.0Da,理论等电点为8.95的蛋白。StCYP707A3含有细胞色素P450半胱氨酸亚铁血红素配体,属于P450单加氧酶家族。StCYP707A3与其他同源蛋白氨基酸序列比对结果表明StCYP707A3与AtCYP707A2在同一簇上。组织表达分析显示,StCYP707A3在根、茎和叶中表达均较低,同时该基因受高盐,真菌及SA的诱导表达。
【作者】张瑞杰；
【导师】杨清；
【作者基本信息】南京农业大学，生物化学与分子生物学，2013，硕士
【关键词】马铃薯；StCYP707A；克隆；块茎形成；调控；

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