茶树低温胁迫转录因子CsICE和CsCBF的亚细胞定位、表达分析及功能验证

【摘要】温度是植物生长环境中的一个重要因素,决定了植物分布的区域。低温会影响作物的产量和品质。因为低温,世界上每年都会遭到巨大损失。植物抗寒分子机能的研究是近几年的研究热点,人们开始探索使用基因工程的手段来提高植物的抗寒能力,以抵制低温对植物的伤害。现在人们广泛使用转基因技术来研究基因的功能。因为茶树本身还没有遗传转化体系,利用转基因技术将基因转化到茶树上,来研究基因功能存在一定难度。所以本研究采用拟南芥这一研究植物基因功能的模式植物为材料,将茶树基因转移到拟南芥中来研究基因的功能。本研究用“迎霜”盆栽茶苗为材料,根据Genebank上登录的CsICE(GQ229032.1)、CsCBF(EU857638.1)基因,从茶苗中克隆到了CsICE、CsCBF基因的开放阅读框,对其进行亚细胞定位,表达量分析,并将其转移到拟南芥中,进一步研究其功能。主要研究成果如下：1.以“迎霜”茶苗为材料,PCR扩增出CsICE、CsCBF的开放阅读框,并对其进行亚细胞定位。定位结果显示,CsICE定位在细胞核中,CsCBF主要定位在细胞核,细胞质和细胞膜中也有该基因的表达。2.以“迎霜”茶苗为材料,研究不同胁迫下CsICE、CsCBF的表达量变化,分别对茶苗进行低温(4℃)处理、ABA(500μM)处理和脱水胁迫(10%PEG6000)处理。结果表明：在ABA胁迫下,CsICE、CsCBF的表达量峰值是所有胁迫中最高的,分别达到对照的40倍和28.5倍；在低温处理下,CsICE、CsCBF的表达量峰值是低于在ABA处理下的,分别是对照的22倍和7倍；脱水胁迫下,CsICE、CsCBF表达量峰值较低,分别是对照的5倍和3倍,CsICE的变化趋势同低温下相近,但变化速率更快,CsCBF的相对表达量一直处于平稳状态,除了2h时显著上调表达,其他时间的表达量与对照无显著性差异。3.以正常生长“迎霜”茶苗的根、茎、叶、芽、花和果为材料,分析CsICE、CsCBF在各组织中的表达量。结果表明CsICE、CsCBF在茶树中各个组织中都普遍存在,但表达量存在组织特异性。CsICE在芽头中的表达量最高,显著高于其他组织的表达,其次是在叶中的表达量较高,在根、茎、果中的表达量最低,并且没有显著性差异。CsCBF在根和芽中的表达量最高,其次是在叶和茎中的表达量较低,在花和果中表达量最低。4.构建了真核表达载体pBI121-GFP/ICE和pCAMBIA1301-GUS/CBF,通过花序浸染法,将CsICE、CsCBF基因转入到拟南芥,并通过抗生素筛选,得到转基因拟南芥。5.分析转基因苗的表型差异性,CsICE过表达拟南芥和野生型拟南芥在表型上无明显差异；CsCBF过表达拟南芥与野生型拟南芥在表型上有明显差异,植株矮化,叶子变小,叶色更绿,叶片变厚,叶形变得狭长。低温处理转基因苗和野生型苗,野生型苗叶片紫叶化程度更重,花青素积累的更多,说明野生型苗受低温伤害更深。6.对CsCBF转基因拟南芥进行低温处理,荧光定量PCR分析CsCBF基因的表达量变化。低温处理4h,表达量明显上调,达到对照的15倍,说明低温胁迫可以诱导CsCBF基因在拟南芥中的表达,并在低温胁迫下,表达量上调。7.在低温胁迫下,通过测定生理指标,研究CsCBF转基因拟南芥的抗寒性。测定结果：在低温条件下,转基因拟南芥的脯氨酸含量始终保持高于野生型拟南芥的水平,而且上升幅度也高于野生型拟南芥；野生型拟南芥丙二醛含量始终高于转基因拟南芥,且丙二醛含量增幅也大于转基因株系；野生型株系的PSII最大光化学效率Fv/Fm,潜在光化学效率Fv/Fo下降的幅度均大于转基因株系,转基因株系的qN成上升趋势,野生型株系的qN成下降趋势。以上生理指标测定结果表明转基因株系比野生型株系有更好的抗寒性效果,CsCBF基因在拟南芥中发挥了作用,增强了植物抵抗低温的能力。
【作者】尹盈；
【导师】房婉萍；
【作者基本信息】南京农业大学，茶学，2013，硕士
【关键词】茶树；低温；CsICE；CsCBF；亚细胞定位；基因表达；功能分析；

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