小鼠脂肪间充质干细胞的分离、鉴定与成肌诱导分化研究

小鼠脂肪间充质干细胞的分离、鉴定与成肌诱导分化研究

作者:师大云端图书馆 时间:2017-11-04 分类:硕士论文 喜欢:3475
师大云端图书馆

【摘要】本研究运用Ⅰ型胶原酶消化法分离4周龄雌性ICR小鼠脂肪间充质干细胞(Adipose-derivedstemcells,ADSCs),进行体外分离培养,随后观察传代生长过程中的形态变化,绘制生长曲线,进行染色体分析,和细胞周期的测定。随后用RT-PCR法对ADSCs进行转录因子的检测,流式细胞仪检测细胞表面标志CD29,CD31,CD44,CD45。结果显示小鼠ADSCs体外培养时呈成纤维细胞样,增殖速度快,各代次细胞经历生长潜伏期、指数生长期和平台期,生长状态无异常,细胞表面标志CD29阳性率为95.51%,CD44为31.63%,CD31为20.22%,CD45表达量极少。RT-PCR检测ADSCs的转录因子结果表明,小鼠ADSCs少量表达Oct-4和C-kit,大量表达Sca-1。可经成脂诱导体系诱导成为脂肪细胞,经过苏丹黑染色显蓝色,并表达PPARy2这一脂肪细胞分化过程中重要的调节因子。可经成骨诱导体系诱导成为成骨细胞,经过茜素红染色呈红色,并表达钙骨素基因。用胶原酶和胰酶联合消化法消化分离小鼠原代肌肉卫星细胞,该方法比组织块等方法得到卫星细胞所用时间短。免疫荧光显示其表达FITC标记的Myod抗体和Cy3标记的Desmin抗体。RT-PCR结果显示,小鼠骨骼肌卫星细胞表达MyoD,Myogenin和Myf5等生肌决定因子,其中MyoD的表达量最高。不同代次之间不同生肌决定因子的表达量不同,新分离的骨骼肌卫星细胞和第二代细胞之间MyoD的表达量差异并不显著,而MyoG的表达量差异显著,而Myf5的表达量差异极其显著,说明骨骼肌卫星细胞在传代生长过程中,迅速地发生分化,逐渐变为生长成熟的成肌细胞,失去分化增殖能力。用不同浓度去甲基化试剂5-氮杂胞苷(5-Aza)处理间充质干细胞寻找最佳培养条件后进行成肌检测。免疫荧光结果表明其定向分化为肌肉细胞的能力强,添加10μmol-L-15-Aza与10%的马血清(HorseSerum,HS)的条件培养基可使诱导效果更好。诱导后部分相邻细胞开始融合,形成类似肌管样的细胞,成肌特异性抗体anti-MyoD和anti-Desmin阳性表达。5-Aza单独诱导组、5-Aza与马血清(HS)协同诱导组与阴性对照脂肪间充质干细胞(ADSCs)组和阳性对照第一代骨骼肌卫星细胞(SCs)组,RT-PCR结果表明各组之间生肌决定因子MyoD,Myogenin和Myf5的表达量有差异,说明其成肌分化的程度不同,并有改善空间。因此,本研究分离培养得到小鼠ADSCs,该细胞取材容易,带入杂质细胞很少,分离方法简便,体外生长增殖能力强,经多次传代后细胞仍生长稳定、增殖速度快、贴壁率高。并且在利用5-Aza以及优化的协同诱导体系可以在较短时间内使其诱导分化为成肌细胞样细胞,并具有表达生肌的标志性蛋白MyoD和肌肉骨架蛋白Desmin的能力,可以作为体外肌组织工程的种子细胞。
【作者】吴海浩;
【导师】周光宏;
【作者基本信息】南京农业大学,食品科学,2013,硕士
【关键词】脂肪间充质干细胞;骨骼肌卫星细胞;成肌分化;生肌因子;

【参考文献】
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