亚急性瘤胃酸中毒对山羊血液皮质醇浓度和肝脏脂代谢的影响及其机制研究

【摘要】反刍动物(如牛、羊等)采食高谷物日粮极易诱发亚急性瘤胃酸中毒(Subacuteruminalacidosis,SARA),该病是现代奶牛养殖业中的一种多发性代谢疾病,严重影响奶牛健康和泌乳性能。SARA的临床症状提示反刍动物处于一种应激状态,但关于动物患SARA时应激轴：下丘脑-垂体-肾上腺皮质(Hypothalamus-pituitary-adrenalgland,HPA)活性状态的报道却很少。因此,本文探索了高精料日粮诱导干奶期和泌乳期奶山羊SARA时血液、瘤胃液中皮质醇浓度及应激轴相关基因与蛋白质的表达变化；并检测泌乳期奶山羊在SARA状态下时肝脏脂代谢及其关键基因的表达变化,从肝脏代谢角度初步揭示SARA引起乳脂率降低的原因。1SARA对干奶期山羊HPA轴活性的影响试验选用干奶期波杂二代山羊12只,随机分为对照组(精粗比4：6)和SARA组(精粗比6：4),试验期21天。定期采集瘤胃液、血液、肝脏等样品,pH计迅速测定瘤胃pH值,并用放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)法检测血液和瘤胃液中皮质醇含量；生化分析法测定血清中总胆固醇(Totalcholesterol,TCH)含量；实时荧光定量PCR法检测HPA轴中与皮质醇合成相关的基因表达,以及皮质醇受体的组织分布等；免疫印记(Westernblot,WB)方法检测肾上腺3p-类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroiddehydrogenase,3β-HSD)和细胞色素P45017a-羟化酶(17a-hydroxylasecytochromeP450,P45017a),及各组织糖皮质激素受体(Glucocorticoidreceptors,GR)基因表达。结果：高精料(精粗比6：4)日粮饲喂山羊3周后成功诱导SARA(SARA组)模型。SARA组山羊采食后瘤胃液pH值小于5.8且持续时间长达4h,而饲喂低精料比例日粮组山羊(精粗比为4：6,对照组)瘤胃液pH值均高于6.0。与对照组相比,SARA组山羊外周血皮质醇浓度无显著变化(P>0.05),但肝静脉和门静脉中皮质醇浓度均显著升高(P<0.05)。SARA组山羊血液胆固醇浓度极显著低于对照组(P<0.01)。Real-timePCR结果显示,与对照组相比,SARA组山羊下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropinreleasinghormone,CRH)和垂体阿片促黑素细胞皮质素原(Proopiomelanocortin,POMC)mRNA表达显著降低(P<0.05),垂体促肾上腺皮质激素释放激素受体(Corticotropinreleasinghormonereceptor,CRHR)mRNA有升高趋势(P=0.07);肾上腺皮质中黑素皮质素受体2(Melanocortintype2receptor,MC2R),类固醇合成急性调节蛋白(Steroidogenicacuteregulatoryprotein,StAR)和细胞色素P45011β-羟化酶(11β-hydroxylasecytochromeP450,P45011β)mRNA表达显著降低(P<0.05);肾上腺皮质3β-HSD和细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(Cholesterolside-chaincleavage,P450scc)mRNA表达分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)升高。Westernblot结果显示,SARA组肾上腺皮质3β-HSD和P450scc蛋白表达分别升高58.6%和39.4%,但未达到统计学显著水平(P>0.05)。与对照组比较,SARA组山羊肝脏GRmRNA表达显著下调(P<0.05),下丘脑GR基因表达有下降趋势(P=0.07),瘤胃上皮组织中GR表达极显著升高(P<0.01),但在海马和垂体中的表达无显著性差异(P>0.05)。以上结果提示,高精料诱导山羊患SARA时HPA轴被激活,使机体处于一定的应激状态。外周组织中GR基因表达的变化提示,SARA时HPA轴的激活可能参与机体代谢,尤其是肝脏和瘤胃上皮物质代谢的改变。2SARA对泌乳中期山羊皮质醇及乳脂生成的影响此部分试验旨在观察短期或长期饲喂高精料日粮对泌乳期奶山羊皮质醇浓度以及肝脏脂代谢的影响。1)短期试验：选择7只装有永久性瘤胃瘘管的泌乳中期本地山羊,2×2拉丁方设计,分别饲喂精粗比为6:4(SARA组)和4：6(对照组)的饲料,试验分两期,每期14d。采集瘤胃液并测定pH值；RIA法检测血液和瘤胃液中皮质醇含量；Realtime-PCR方法检测肝脏GRmRNA表达量。结果：饲喂高精料比例(60%)日粮2周后成功诱导泌乳期山羊发生SARA(SARA组)。SARA组山羊采食后瘤胃液pH值低于5.8且持续约6h,采食前SARA组山羊血浆皮质醇浓度有高于对照组的趋势(P=0.05),但采食后6h两组间无显著差异(P>0.05)；瘤胃液皮质醇浓度在采食后2,4和6h分别显著高于对照组(P<0.05),但在采食前和采食后10h两组间无显著差异(P>0.05)。Real-timePCR结果显示,SARA组山羊肝脏GRmRNA表达显著下调(P<0.05)。本研究结果提示,泌乳期山羊发生SARA时糖皮质激素水平升高,反馈性下调肝脏GRmRNA表达。2)长期试验：选择8只装有永久性瘤胃瘘管的泌乳中期萨能奶山羊,随机分为对照组(n=4)和SARA组(n=4),分别饲喂精粗比4：6和6：4的饲料,试验持续9周。每两周检测一次瘤胃液pH值和乳成分；RIA法检测血液、瘤胃液和乳样中皮质醇含量；全自动血液分析仪检测血浆中谷草转氨酶、葡萄糖、甘油三酯(Triglycerol,TG)、游离脂肪酸(Nonesterifiedfattyacid,NEFA)等含量；Realtime-PCR方法检测肝脏GR及脂代谢相关基因表达量；Westernblot方法检测肝脏GR和长链脂酰辅酶A合成酶(LongchainacylCoAsynthetase,ACSL1)蛋白表达。结果：试验第2周,SARA组山羊采食后瘤胃液pH值小于5.8且持续4h;由于机体对高精料的适应和瘤胃缓冲能力的增强,试验第4-9周瘤胃pH值有所升高,但仍显著低于对照组(P<0.05)。第6-9周时,SARA组乳脂率和乳蛋白率都显著低于对照组(P<0.05),试验第2周乳脂率即开始极显著低于对照组(P<0.01)；第8周乳糖显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,SARA组血液中谷草转氨酶和游离脂肪酸浓度有升高趋势(P<0.1),葡萄糖浓度显著升高(P<0.05),肝脏甘油三酯和总胆固醇浓度显著降低(P<0.05)。SARA组瘤胃液皮质醇浓度在采食前有升高趋势(P<0.1),采食后2h极显著升高(P<0.01)；采食后8h血液和瘤胃液皮质醇浓度均显著高于对照组(P<0.05)。试验第8周,SARA组羊乳中皮质醇浓度显著高于对照组(P<0.05)。SARA组山羊肝脏GRmRNA和蛋白表达均显著下降(P<0.05)。肝脏脂代谢基因乙酰辅酶A转乙酰基酶(AcetylcoenzymeAacyltransferase2,ACAA2)和3-羟脂酰辅酶A脱氢酶(3-hydroxyacylCoAdehydrogenase,HADH)mRNA表达显著升高(P<0.05),ACSL1mRNA有升高趋势(P<0.1),且肝脏中ACSL1蛋白表达极显著升高(P<0.01)。以上结果提示：长期饲喂高精料日粮导致乳品质降低,体液皮质醇水平升高；肝脏脂肪酸分解代谢处于激活状态,可能与机体在免疫应激状态下的能量需求增加有关,从而消耗过多乳脂前体物,导致乳脂合成减少。
【作者】贾媛媛；
【导师】倪迎冬；
【作者基本信息】南京农业大学，基础兽医学，2013，硕士
【关键词】SARA；HPA轴；乳脂；肝脏；山羊；

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