DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞生物学特性的影响及其调节睾酮合成机制的研究

【摘要】脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone,DHEA)作为胆固醇代谢途径中的重要中间产物,是机体中各种类固醇激素合成的重要前体。已有研究表明,DHEA在调节机体神经系统、免疫系统、骨质代谢、脂肪代谢等方面都发挥着重要作用。目前,大多数学者认为,DHEA主要是在外周靶组织/靶细胞中转化为睾酮或雌二醇而发挥其特有的生物学功能。睾丸间质细胞分布于睾丸曲精小管间的疏松结缔组织,其主要功能是合成和分泌睾酮,血浆睾酮的95%由睾丸间质细胞分泌。本实验室前期研究结果表明,外源性添加DHEA可促进不同生理期实验大鼠血清中睾酮和雌二醇的分泌；在TM-3细胞(小鼠睾丸间质细胞系)上证实,DHEA处理可显著抑制TM-3细胞的增殖,但却能够显著增强TM-3细胞线粒体的功能；同时发现DHEA在TM-3细胞内主要向睾酮和雌二醇进行转化,但其具体机制还不是很清楚。因此,本试验在分离、纯化和鉴定原代大鼠睾丸间质细胞的基础之上,探讨DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞增殖、细胞周期、线粒体膜电位等生物学特性的影响；在证实DHEA影响原代大鼠睾丸间质细胞合成睾酮的基础之上,重点从蛋白水平上检测DHEA对类固醇激素合成过程中代谢关键酶表达的影响,继而探讨MAPK-ERK信号通路以及核转录因子CREB在调节原代大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮中的作用。研究旨在揭示DHEA对特定靶细胞的生物学特性的影响,并从信号转导通路的角度深入阐明其调节靶细胞合成类固醇激素的作用机制,以期为深入阐明DHEA的生物学功能提供理论基础和实验依据。1DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞增殖特性的影响本试验以原代大鼠睾丸间质细胞为研究对象,探讨DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞增殖以及细胞周期的影响。以含DHEA终浓度分别为0mol/L.1μmol/L.50μmol/L和100μmol/L的培养液孵育细胞24h后,分别采用倒置相差显微镜观察和EdU法检测DHEA对细胞增殖的影响；流式细胞术检测不同浓度的DHEA处理6h、12h、24h和48h后,其对原代大鼠睾丸间质细胞周期的影响：Real-timePCR检测DHEA处理细胞24h后,细胞周期相关因子CyclinA.CDK2和CyclinBmRNA表达水平的变化。结果表明,倒置相差显微镜下可观察到DHEA具有明显抑制细胞增殖的作用；EdU法检测进一步证实,50μmol/L和100μmol/LDHEA处理能够抑制细胞增殖。与对照组相比,100μmol/LDHEA处理12h-48h,可显著升高原代大鼠睾丸间质细胞中S期细胞的比例、降低G2/M期细胞比例(P<0.01)；50μmoyLDHEA处理48h,可显著升高S期细胞的比例,降低G2/M期细胞比例(P<0.01)。与对照组相比,100μmol/LDHEA处理可显著降低原代大鼠睾丸间质细胞中CyclinA和CDK2mRNA的表达水平(P<0.05),但不同浓度的DHEA处理对CyclinBmRNA的表达均未达到统计学上的显著影响(P>0.05)。提示,DHEA处理可显著抑制原代大鼠睾丸间质细胞增殖,其主要机制是DHEA可显著抑制细胞周期相关因子CyclinA和CDK2mRNA的表达水平,致使原代大鼠睾丸间质细胞滞留于S期,从而抑制细胞的增殖。2DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞线粒体功能的影响本试验以原代大鼠睾丸间质细胞为研究对象,探讨DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞线粒体结构和功能的影响。用不同浓度DHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞后,分别采用MTT法检测细胞活力、透射电镜观察细胞线粒体形态及数目、流式细胞术检测线粒体膜电位(△Ψm)、试剂盒法测定琥珀酸脱氢酶(SDH)活性变化。结果显示,与对照组相比,0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L.50μmol/L,100μmol/L和200μmol/LDHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞24h-48h,不同浓度的DHEA处理均可极显著提高细胞的活力(P<0.01)。1μmol/L,50μmol/L和100μmol/LDHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞48h,细胞线粒体形态和数目与对照组相比均无显著性变化(P>0.05)。与对照组相比,不同浓度的DHEA处理均可降低原代大鼠睾丸间质细胞线粒体的膜电位；其中100μmol/LDHEA处理可极显著降低细胞线粒体膜电位(P<0.01)。1μmol/LDHEA处理对胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)活性并无显著影响(P>0.05),但50μmol/L和100μmol/LDHEA处理可极显著提高胞内SDH的活性(P<0.01)。结果提示,DHEA处理可降低原代大鼠睾丸间质细胞线粒体的膜电位而使其通透性增加,同时其可通过提高SDH的活性而增强自身氧化代谢水平,从而显著提高原代大鼠睾丸间质细胞的活力。3DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞睾酮合成及关键酶表达的影响本试验以原代大鼠睾丸间质细胞为研究对象,探讨外源性DHEA处理对原代大鼠睾丸间质细胞睾酮的合成及其合成途径中关键酶表达的影响。以含DHEA终浓度分别为0μmol/L,1μmol/L,50μmol/L和100μmol/L的培养液孵育大鼠睾丸间质细胞24h,以放射免疫分析法检测睾酮含量,以Real-timePCR法检测3β-羟基固醇脱氢酶(3p-HSD)、17β-羟基固醇脱氢酶(17β-HSD)mRNA表达水平的变化；继而以100μnol/LDHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞0h、3h、12h、24h和48h,以Westernblot法检测3β-HSD,17β-HSD和Aromatase蛋白表达的变化。试验结果表明,DHEA能够显著促进原代大鼠睾丸间质细胞睾酮的合成,且呈现明显的剂量效应。50μmol/LDHEA处理可显著提高3p-HSDmRNA的表达水平,100μmol/LDHEA处理则可极显著提高3p-HSDmRNA的表达水平(P<0.01)；同时,100μmol/LDHEA能够显著提高17β-HSDmRNA表达水平(P<0.05)。Westernblot分析结果表明,与Oh时相比较,100μmol/LDHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞12h-48h可显著升高3p-HSD蛋白表达水平(P<0.05),100μmol/LDHEA处理48h能显著降低芳香化酶的蛋白表达水平(P<0.05),但DHEA处理不同时间对17β-HSD蛋白表达水平并无显著性变化(P>0.05)；与同时间点的对照组相比,100μmol/LDHEA处理细胞24h-48h可显著提高3β-HSD和17β-HSD蛋白表达水平(P<0.05),而100\μmol/LDHEA处理细胞24h-48h则可显著降低Aromatase蛋白表达水平(P<0.05)。以上结果提示,DHEA处理可显著上调原代大鼠睾丸间质细胞中3p-HSD和17p-HSD的mRNA和蛋白表达、下调Aromatase蛋白表达,进而促进原代大鼠睾丸间质细胞中睾酮的合成。4DHEA调节原代大鼠睾丸间质细胞睾酮合成相关信号通路的研究本试验以原代大鼠睾丸间质细胞为研究对象,进一步探讨DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞睾酮合成相关信号通路的影响。结果显示,不同浓度的DHEA处理,原代大鼠睾丸间质细胞内ERK1/2蛋白水平并未呈现明显变化(P>0.05),但50μmol/L和100μmol/LDHEA处理可极显著提高p-ERK1/2蛋白水平(P<0.01)。100μmol/LDHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞不同时间后,ERK1/2蛋白水平并未呈现明显变化(P>0.05)；100μmol/LDHEA处理细胞30min和120min,可以极显著提高p-ERK1/2蛋白水平(P<0.01)；加入p-ERK1/2的抑制剂U0126处理后,DHEA对p-ERK1/2的这种促进作用可完全被逆转。无论有、无抑制剂存在的条件下,1μmol/L、50μmol/L和100μmol/LDHEA处理均可显著提高原代大鼠睾丸间质细胞睾酮的含量(P<0.01),且均呈现出明显的剂量效应；同一剂量的DHEA处理条件下,抑制剂处理组睾酮的含量与无抑制处理组相比均明显降低,且50μmol/L和100μmol/LDHEA处理时呈现显著差异(P<0.05)。与对照组相比,100μmol/LDHEA处理可显著提高原代大鼠睾丸间质细胞3β-HSD蛋白和17β-HSD蛋白的表达水平(P<0.05),抑制剂U0126预处理可显著逆转DHEA对睾丸间质细胞3p-HSD和17p-HSD蛋白表达水平的影响(P<0.05)；100μmol/LDHEA处理可极显著降低原代大鼠睾丸间质细胞Aromatase蛋白的表达水平(P<0.01),但抑制剂U0126预处理并不能消除DHEA对Aromatase蛋白表达水平的抑制效应。100μmol/LDHEA处理原代大鼠睾丸间质细胞30min,CREB蛋白水平并未呈现明显变化(P>0.05)；但50μmol/L和100μmol/LDHEA处理大鼠睾丸间质细胞30min,可以极显著提高p-CREB的蛋白表达水平(P<0.01)。结果提示,DHEA处理可通过激活MAPK-ERK信号通路和上调p-CREB的表达,调节类固醇代谢途径中关键酶的表达,进而促进原代大鼠睾丸间质细胞中睾酮的合成。
【作者】刘琳；
【导师】马海田；
【作者基本信息】南京农业大学，基础兽医学，2013，硕士
【关键词】脱氢表雄酮；原代大鼠睾丸间质细胞；细胞增殖；线粒体功能；睾酮；信号通路；

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