梨蔗糖与磷脂酰胆碱转运蛋白基因的克隆、序列分析及特性研究

【摘要】梨果实内的糖主要以蔗糖和山梨醇的形态经韧皮部进入果实被贮藏和利用,糖的运输和分配方式不仅调控梨的整个生长和发育进程,也决定了其产量和品质。植物体内蔗糖从源到库的定向转运过程中,蔗糖转运蛋白(Sucrosetransporter,SUT)起着重要的调节作用。而磷脂酰胆碱是生物膜的重要组成成分之一,对于稳定细胞膜结构有着重要的作用,其主要通过磷脂酰胆碱转运蛋白(PCTP)来运输,PCTP具有START结构域,参与胞内脂质运输、代谢,细胞信号传导,在高等植物的发育调节过程和逆境响应中起着重要作用。目前国内外对这两个基因的功能了解及研究十分有限。SUT2作为一个膜蛋白,在蔗糖转运过程中起重要作用。PCTP在酵母与动物中研究较多,植物中研究很少,磷脂酰胆碱转运蛋白(PCTP)负责脂质转运,对细胞膜的稳定起着重要作用,也对蔗糖转运有重要的影响。本实验通过对这两个基因的克隆、生物信息学分析、表达分析、亚细胞定位等,探讨梨中这两个基因的功能及在蔗糖和脂质转运过程中所起的作用。为促进果实糖分的积累与转运、提高梨果实品质奠定理论基础。主要研究结果如下：1.以‘翠冠’梨(PyruspyrifoliaNaKai.’Cuiguan’)为材料,通过转录组测序结果,设计引物扩增梨SUT2基因,BLAST比对发现其与草莓SUT2基因的同源相似性达81%,为蔗糖-质子共运输蛋白家族,有11个跨膜结构域,并命名为PySUT2.通过生物信息学分析发现,此蛋白为疏水性蛋白,利于跨膜结构的形成。qRT-PCR分析表明,PySUT2在梨的整个植株中都有表达,其中在芽中的表达量最高；对该基因在果实生长期的表达分析表明,随着果实的发育,PySUT2表达量在4月底有所增长,之后逐渐降低,在7月底表达量最低。利用pCXDG载体进行亚细胞定位,结果显示,PySUT2基因编码的蛋白分布在细胞膜上。通过原核表达SDS-PAGE电泳检测结果表明,该基因可诱导表达为一个70kD左右的蛋白。推测PySUT2与蔗糖转运无直接关系,可能是质膜蔗糖信号感应器。2.以‘丰水’梨(PryuspyrifoliaNaKai.’Housui’)为材料,根据转录组测序结果,结合RCAE和Genomewalking获得了梨磷脂酰胆碱转运蛋白基因的完整读码框序列,BLAST比对发现与蓖麻的磷脂酰胆碱转运蛋白有69%的同源性。其具有STARTdomain(启动域)、ZnFTAZ(TAZ锌指结构)、DCD(双氰胺)保守结构域,将其命名为PyPCTP1。对PyPCTP1基因编码的氨基酸进行生物信息学分析,发现此蛋白为亲水性蛋白,有一个跨膜区,洋葱表皮亚细胞定位观察结果显示,PyPCTP1基因编码的蛋白分布在细胞膜上。用激素生长素(IAA),脱落酸(ABA),水杨酸(SA),赤霉素(GA),细胞分裂素(6-BA)及NaCl诱导处理,发现与对照(CK)相比,SA和GA处理后PyPCTP1基因表达量显著上升；NaCl和IAA处理后PyPCTP1基因的表达量随时间逐渐上升,但没有SA和GA表达量高；而对ABA,6-BA不能增加目的基因的表达量。据此推测PyPCTP1是一个参与脂质转运蛋白基因,可能参与梨的逆境胁迫抗性反应。
【作者】唐娟；
【导师】常有宏；
【作者基本信息】南京农业大学，果树学，2013，硕士
【关键词】梨；蔗糖转运蛋白；磷脂酰胆碱转运蛋白；基因克隆；表达分析；

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