展示在XL1-Blue大肠杆菌表面的链球菌GapC_(1-150aa)免疫原性研究

【摘要】奶牛乳房炎是引起奶业重大经济损失的最常见疾病之一。该病主要由无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等引起。随着耐药菌株不断出现和对奶中残留药物的限制，迫切需要研究能够同时预防多种病原菌感染的奶牛乳房炎疫苗。以往研究表明，链球菌表面GapC蛋白具有良好的免疫原性，能够预防奶牛乳房炎3种链球菌感染，并且GapC1-150aa具有与GapC全蛋白相近的免疫保护作用。本研究拟利用Red重组技术在大肠杆菌XL1-blue株表面展示GapC1-150aa蛋白，并研究其表面GapC1-150aa的免疫原性。为进一步研究用引起奶牛乳房炎的大肠杆菌展示链球菌抗原疫苗提供参考。本研究通过Red重组技术以构建的融合基因lpp’ompA-gapC1-150aa替换ompA基因，实现GapC1-150aa在大肠杆菌表面展示。根据已发表的停乳链球菌gapC、大肠杆菌ompA和lpp、质粒pKD3中cm基因序列设计引物，并通过重叠延伸PCR技术分别构建lpp’ompA-gapC1-150aa-cm和lpp’ompA-cm基因打靶片段，经电击转化将打靶片段导入含有质粒pKD46的大肠杆菌XL1-Blue中，构建重组菌株XL1-Blue/LOG76和对照菌株XL1-Blue/LO11。通过PCR扩增、基因测序、Western-blotting、全菌体ELISA、流式细胞术和激光共焦显微镜观察等方法检测和定位GapC1-150aa表达，结果证实GapC1-150aa借助Lpp’OmpA正确展示在大肠杆菌XL1-Blue表面，且构建菌株培养的生长情况无明显改变。将XL1-Blue/LOG76、XL1-Blue/LO11和GapC1-150aa蛋白用弗氏佐剂乳化后，分别接种ICR小鼠，并采取血清检测GapC1-150aa特异性抗体水平和抗体亚类，用ELISPOT检测IL-4和IFN-γ、间接ELISA方法检测IL-17A；然后分别用乳房链球菌、停乳链球菌和无乳链球菌菌株对免疫小鼠攻毒。结果，XL1-Blue/LOG76和GapC1-150aa均能够刺激产生高水平的特异性抗体；XL1-Blue/LOG76和GapC1-150aa组均能产生高水平的IL-4、IFN-γ、IL-17A与对照组相比差异显著；攻毒结果：S.uberisSD0306株攻毒，XL1-Blue/LOG76组的存活率为33%、XL1-Blue/LO11组存活率为17%，GapC1-150aa组存活率为67%、PBS组存活率为8%；S.dysgalactiaeLS0312株攻毒，XL1-Blue/LOG76组存活率为42%、XL1-Blue/LO11组和PBS组存活率均为17%，GapC1-150aa组存活率为67%；S.agalactiaeLS0310株攻毒,XL1-Blue/LOG76组存活率为42%、XL1-Blue/LO11组存活率均为8%，GapC1-150aa蛋白组的存活率为58%、PBS组小鼠全部死亡。结果表明，本实验构建的XL1-Blue/LOG76成功将链球菌GapC1-150aa展示在E.coli表面，且能给免疫小鼠提供一定抗链球菌感染的能力。
【作者】杨汐静；
【导师】崔玉东；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】奶牛乳房炎；链球菌GapC蛋白；大肠杆菌表面展示；免疫保护；

【参考文献】
[1]李鹏.基于相位调制的微波光子链路线性化研究[D].西南交通大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[2]叶伏秋.低维纳米体系载流子弹性输运性质的研究[D].湖南大学,2011.
[3]王翼.我国竞技网球竞赛体制接轨国际职业化网球竞赛体制的研究[D].天津体育学院,社会体育指导（专业学位）,2014,硕士.
[4]汪涛.中铁四局集团企业内部控制体系研究[D].安徽大学,工商管理,2012,硕士.
[5]李祥杰.面向损耗模拟的直流无刷轮毂电机内部温度预测研究[D].吉林大学,车辆工程,2013,硕士.
[6]赖华清.铝/钢添加铅中间层CMT熔—钎焊工艺及组织性能研究[D].江苏科技大学,材料加工工程,2014,硕士.
[7]段艳华.初中信息技术课程有效教学方法的研究[D].河北师范大学,教育学原理,2012,硕士.
[8]莫惠.戴君恩《读风臆评》研究[D].广西师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[9]朱伟新,冯文卓.罩式炉全自动控制系统设计与实现[J].冶金自动化,2009,05:42-46.
[10]王素洁,李想.基于社会网络视角的可持续乡村旅游决策探究——以山东省潍坊市杨家埠村为例[J].中国农村经济,2011,03:59-69+90.
[11]张丽娟.α-MSH对糖尿病视网膜血管内皮细胞保护作用的机制研究[D].天津医科大学,眼科学,2014,博士.
[12]马萍.生命周期视角下创业板企业价值评估研究[D].北京交通大学,2014.
[13]吴敏捷,尚岳全,范立峰,潘攀,魏振磊.采用塑料浮管处理软土地基的力学作用分析[J].华东公路,2015,01:92-96.
[14]陈盛.中国古诗词艺术歌曲之“形”与“意”[D].西北师范大学,艺术,2013,硕士.
[15]魏雪超.Fe原子单层/石墨烯混合结构的物性研究[D].延边大学,2011.
[16]惠少兴.三维Q值层析成像[D].中国地震局兰州地震研究所,固体地球物理学,2012,硕士.
[17]王丽娟,刘苏萌.《微生物学》实验课程教学改革的探索与实践[J].轻工科技,2015,02:176-177.
[18]马兴.春秋时期山西境内的北狄[D].河北师范大学,中国古代史,2004,硕士.
[19]徐新明.三个“创新”是中小企业解困的关键[J].环渤海经济瞭望.1999(04)
[20]潘青.《电厂项目技术规范书》翻译项目的实践报告[D].山东大学,英语笔译（专业学位）,2013,硕士.
[21]袁继鑫.野生蓝莓菌根真菌的分离、鉴定及接种效应[D].北京林业大学,森林培育学,2013,硕士.
[22]杨转琴.汉中市土地综合承载力研究[D].长安大学,农业资源利用（专业学位）,2014,硕士.
[23]冯莹.无碳化物贝氏体钢的显微组织、力学性能和疲劳裂纹扩展行为[D].燕山大学,材料学,2013,硕士.
[24]候玉婷.黑河流域上游高分辨率降水驱动分析及NoahLSM的径流响应模拟[D].兰州大学,地球系统科学,2013,硕士.
[25]刘放.当代大学生权利义务观念现状及教育研究[D].吉林大学,思想政治教育,2014,硕士.
[26]孙玉安.高中文言文情感教学研究[D].东北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[27]钱娜娜.北京市产业结构升级对流动人口的影响与挑战[D].首都经济贸易大学,人口、资源与环境经济学,2013,硕士.
[28]孙维毅.基于双目立体视觉的自主资源勘探车辆环境识别技术研究[D].吉林大学,车辆工程,2014,硕士.
[29]范又功.渐开线谐波齿轮副波发生器的互换性问题[J].仪表技术与传感器.1993(05)
[30]马晓东.聚苯乙烯纳米复合材料的制备及其在电化学分析中的应用[D].宁夏大学,2013.
[31]刘小君.实时中间件研究及实现[D].广东工业大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[32]吴健雄.CTCS-3级车载DMI界面信息自动识别方法及工具的研究[D].北京交通大学,2015.
[33]卢大力.我国减刑制度研究[D].河北大学,法律,2013,硕士.
[34]韩慧超.陆地棉LTP家族基因的克隆与功能的初步研究[D].上海交通大学,植物学,2013,硕士.
[35]常春阳.基于电路地图的智能交通路径规划与导航系统[D].河北工业大学,控制工程,2013,硕士.
[36]张梅.休闲视野下北京市城市居民家庭体育与生活满意度的研究[D].首都体育学院,体育教育训练学,2013,硕士.
[37]张昕.重庆市土地资源可持续利用评价及对策研究[D].重庆大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[38]杨铮.微博在高中文言文教学中的应用策略[D].河北大学,教育技术学,2013,硕士.
[39]赵昆.动态多尺度系统投影算子及非线形滤波器设计[D].西北工业大学,模式识别与智能系统,2004,硕士.
[40]简爽.小城镇水环境污染分析与控制途径研究[D].西安建筑科技大学,市政工程,2013,硕士.
[41]陈哲.建国以来新疆工笔人物画发展研究[D].新疆师范大学,美术学,2014,硕士.
[42]王朝熙.湖北剧院铝锰镁合金板斜屋面施工[J].建筑技术.2003(07)
[43]刘林.胺液在线净化复活技术在石油化工企业中的应用[D].东北石油大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[44]石兴民,吕增建.多层体系结构在数据挖掘系统中的应用研究[J].电脑与信息技术,2004,01:1-4.
[45]祁怀鹏.中国上市公司高管薪酬影响因素研究[D].山东大学,企业管理,2013,硕士.
[46]朱晓华.浅析数据挖掘技术在图书馆自动化中的应用[J].图书馆学研究,2002,05:41-42+45.
[47]缪明学.基于STM32中频逆变电源点焊控制系统的研究[D].南昌航空大学,材料加工工程,2013,硕士.
[48]李佳佳.快递企业侵害个人客户权益法律问题研究[D].河北经贸大学,法律,2014,硕士.
[49]彭文青.杨宪益文化观对其英译《红楼梦》的影响[D].上海外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[50]张维,林文钊,陈焰.业务运营支撑系统下一步建设思路探讨[J].电信工程技术与标准化,2003,12:66-71.