基于酶联免疫法的中华绒螯蟹体内恩诺沙星药代动力学研究

【摘要】恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）是第3代喹诺酮类抗生素，因其具有高效、抗菌谱广、与其它抗生素之间无交叉耐药性等特性而被应用于防治水产动物细菌性疾病。中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）是名贵养殖品种之一，在养殖过程中常遭受细菌性疾病危害，ENR也是防治中华绒螯蟹细菌性疾病的常用药，因而存在残留的风险。色谱法检测ENR残留检测限低、高效，但样品前处理较为繁琐、耗时、成本高。因而，本研究通过优化ENR多克隆抗体制备技术，建立了灵敏、特异、快速、简便的ELISA分析方法，并应用该检测方法研究了给药次数、健康状况、水温等因素对中华绒螯蟹体内ENR药代动力学及残留消除规律的影响，取得如下主要结果：1、采用优化的碳二亚胺法合成免疫原（cBSA-ENR）、N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法合成包被抗原（cOVA-ENR）及免疫方式等技术，制备ENR多克隆抗体，并用方阵ELISA及间接竞争ELISA对其滴度、亲和力及特异性进行分析。结果表明，ENR多抗的工作浓度为1:80000，IC50为8.68ng/mL，有效检测范围为0.40~125ng/mL，与环丙沙星等竞争物的交叉反应率均小于0.50%；分别在中华绒螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺样品中添加10、30和90ng/g(ng/mL)3个浓度水平的ENR，平均回收率分别为72.23%~85.45%、68.66%~74.12%和50.17%~56.30%，相对标准偏差分别为7.64%~12.26%、12.41%~22.23%和28.28%~35.40%。说明采用优化的制备技术获得的ENR多克隆抗体及其建立的免疫分析方法能够满足中华绒螯蟹等水产品中ENR残留检测的基本要求。2、在不同给药次数、不同健康状况及不同水温条件下口灌ENR（10mg/kg），应用ELISA法测定灌药后5、10min及0.5、1、2、4、8、12、24、48、96和168、240h时中华绒螯蟹血淋巴、肌肉和肝胰腺中的ENR残留量，药代动力学分析软件3P97计算药代动力学参数并拟合房室模型，结果表明：（1）在单次和多次口灌（连续口灌三天，每天一次）的给药方式下，中华绒螯蟹血淋巴和肌肉中ENR含量均呈现随给药时间先上升后下降的现象。单次口灌中华绒螯蟹血淋巴、肌肉和肝胰腺的吸收半衰期（T1/2ka）分别为0.27h、0.27h、2.18h，分布半衰期（T1/2α）分别为3.65h、7.39h、19.86h，消除半衰期（T1/2β）分别为15.26h、29.94h、42.92h；而多次口灌下3种组织中的T1/2ka分别为0.26h、0.24h、0.07h，T1/2α分别为3.81h、9.04h、23.05h，T1/2β分别为18.50h、33.21h、48.41h。表明单次口灌比多次口灌分布和消除都快；各组织中ENR含量从大到小依次为：肝胰腺、血淋巴、肌肉。3P97软件分析结果表明，不同给药次数下中华绒螯蟹血淋巴、肌肉和肝胰腺中ENR的代谢规律均符合一级吸收二室开放模型；。根据农业部无公害食品兽药残留标准，建议25℃水温条件下口服ENR（10mg/Kg）预防中华绒螯蟹疾病时休药期不少于375℃d。（2）在水温25℃时，以10mg/kg剂量单次口灌健康的和感染嗜水气单胞菌的中华绒螯蟹后，ENR在健康组中华绒螯蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺的T1/2ka分别为0.27h、0.27h、2.18h，T1/2α分别为3.65h、7.39h、19.86h，T1/2β分别为15.26h、29.94h、42.92h；而染菌组3种组织中的T1/2ka分别为0.87h、1.35h、2.56h，T1/2α分别为1.34h、2.59h、8.61h，T1/2β分别为14.04h、40.28h、7.96h。与健康蟹相比，染菌蟹各组织中ENR含量较低、吸收较慢，但分布和消除快。ENR在各组织中的含量从大到小依次为：肝胰腺、肌肉、血淋巴。3P97软件分析结果表明，不同健康状况下中华绒螯蟹血淋巴、肌肉和肝胰腺中ENR的代谢规律均符合一级吸收二室开放模型。建议25℃水温条件下口服ENR（10mg/Kg）治疗中华绒螯蟹疾病时休药期不少于300℃d。（3）在20、25和30℃水温下，以10mg/kg剂量单次口灌人工感染了嗜水气单胞菌的中华绒螯蟹后，血淋巴和肌肉组织中ENR含量均出现先上升后下降的现象，而肝胰腺中药物时间曲线均出现两个峰值，且第二峰峰值浓度均高于第一个峰峰值浓度。各组织中ENR吸收、分布和消除随水温升高而加快。3P97软件分析结果表明：不同水温下染菌蟹的血淋巴、肌肉和肝胰腺中ENR的代谢规律均符合一级吸收二室开放模型，而且血淋巴、肌肉和肝胰腺的药时曲线下总面积（AUC）均与水温呈负相关，而总体消除率（CLs）与水温呈正相关。
【作者】徐逍；
【导师】宋学宏；
【作者基本信息】苏州大学，渔业（专业学位），2014，硕士
【关键词】中华绒螯蟹；恩诺沙星；多克隆抗体；酶联免疫吸附测定；药代动力学；

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