锦鲤疱疹病毒诱导的细胞凋亡与抗病毒药物筛选

【摘要】鲤鱼,包括观赏性的锦鲤,是欧洲和亚洲的重要淡水养殖品种,具有重要的经济与生态价值。然而,自1998年在以色列和美国暴发锦鲤疱疹病毒病以来,锦鲤疱疹病毒病随后在全球范围流行。锦鲤疱疹病毒病的病原为锦鲤疱疹病毒(KoiHerpesvirus,KHV),因其是从鲤科鱼体内分离鉴定的第三个疱疹病毒,因此其又称为鲤疱疹病毒Ⅲ型(CyprinidHerpesvirus3,CyHV-3)。由KHV感染养殖鲤鱼引起的疱疹病毒病是近年严重危害我国鲤鱼养殖业的一种重大传染性疾病,已经造成重大经济损失。目前,锦鲤疱疹病毒病尚无有效的防治方法。本文研究了KHV感染锦鲤鳍条细胞(Koi-Fin)诱导其发生凋亡的过程,并在建立的细胞感染系统中进行了抗锦鲤疱疹病毒天然药物筛选,为锦鲤疱疹病毒病防治技术研究与应用奠定了前期基础。研究内容和结果如下：1.锦鲤疱疹病毒(KHV)感染锦鲤鳍条细胞(Koi-Fin)诱导其发生凋亡的研究。KHV感染锦鲤鳍条细胞(Koi-Fin),根据凋亡形态学特征检测,采用hoechst33258染色检测方法,根据凋亡生化特征检测,采用TUNEL反应、DAN片段化检测、流式细胞术检测细胞周期以及流式细胞术检测线粒体膜电位变化方法,研究了KHV诱导Koi-Fin细胞发生凋亡的过程。KHV感染锦鲤鳍条细胞后,细胞变圆、皱缩、折光度增强,随后细胞脱落,细胞单层呈网状,感染96h后出现典型细胞病变效应(CPE)。KHV感染Koi-Fin细胞72h后,hoechst33258染色结果显示,KHV感染Koi-Fin细胞72h后,Koi-Fin细胞的染色质固缩亮染、细胞核边缘化或破裂,出现质膜包被的凋亡小体,且Koi-Fin细胞凋亡率与KHV感染细胞时间成正相关；TUNEL反应结果表明,KHV感染72h后,细胞基因组DNA出现断裂,有大量3-OH末端存在。DNAladder检测结果显示,KHV感染Koi-Fin细胞48h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯带条带,且随感染时间延长而逐渐增强,96h达到最高。病毒感染72h后流式细胞仪检测亚G1期细胞,结果显示,被KHV感染的细胞约42.8%处于凋亡细胞特有的亚G1期；采用JC-1荧光探针检测KHV感染Koi-Fin细胞的线粒体膜电位变化,结果表明,KHV感染Koi-Fin细胞72h后,其线粒体膜电位降低,通透性发生改变。2.抗KHV药物筛选的研究。采用细胞病变效应观察和活细胞染色法(MTS),研究了天然植物药物在细胞培养模型上抑制锦鲤疱疹病毒复制的效果。药物安全浓度试验结果表明,银黄、黄芪多糖、板兰根、炎琥宁以及穿心莲对锦鲤鳍条组织细胞的安全浓度分别为15.63mg/mL、2.5mg/mL、31.25mg/mL、31.25mg/mL和6.25mg/mL。在先给药后感染试验组,银黄、黄芪多糖、板蓝根和炎琥宁的浓度分别为15.63mg/mL、2.5mg/mL、31.25mg/mL和6.25mg/mL时,有明显的抑制KHV复制的效果,治疗指数分别为22.88±3.26、21.07±4.86、24.76±3.24和18.20±2.78；穿心莲抑制病毒复制的效果不明显。在先感染后给药试验组,银黄、板蓝根和炎琥宁浓度分别在15.63mg/mL、31.25mg/mL和6.25mg/mL时有显著抑制KHV增殖作用,治疗指数分别为33.21±7.71、21.99±3.12和15.91±3.23。使用天然植物药物处理病毒后再感染细胞,仅观察到板蓝根为浓度为31.25mg/mL时对KHV有较弱的直接杀灭作用,治疗指数为5.7+1.62,而银黄、黄芪多糖、穿心莲和炎琥宁没有直接杀灭KHV的效果。本研究的结果为药物防治养殖鲤鱼的疱疹病毒病提供了一定的理论依据。
【作者】李俊超；
【导师】曾令兵；
【作者基本信息】华中农业大学，水产养殖，2014，硕士
【关键词】锦鲤疱疹病毒；锦鲤鳍条细胞系；细胞凋亡；抗病毒；药物筛选；效果；

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