鸭甲型肝炎病毒VP0、VP1截短基因的表达及初步应用

【摘要】鸭病毒性肝炎(DuckViralHepatitis,DVH)是由小RNA病毒DHV(DuckHepatitisVirus)引起的一种以雏鸭肝炎和出血为主要病变的传染性极强的疾病。VP0、VP1作为DHV的主要结构蛋白,有很好的免疫原性。通过对VP0、VP1基因截短,筛选出亲水性强的优势抗原区并进行表达,制备了VP0、VP1截短基因的多克隆抗体(PcAb),建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗原抗体的快速检测方法。1.VP0、VP1截短基因的表达以VP0、VP1基因为模板,经PCR扩增得到VP0F1、VP0F2、VP0F3、VP1F1、VP1F2共5段序列,将VPOF1-3,VP1F1-2各自拼接得到VP0、VP1截短基因。将VP0、VP1截短基因克隆到表达载体pET28a,构建pET28a-VP0/VP1(截短)重组质粒,在16℃C过夜条件下经IPTG诱导获得VP0、VP1截短蛋白并进行纯化。结果经SDS-PAGE及westernblot分析,证明VP0、VP1截短蛋白纯化效果良好,免疫原性强。2.鸭甲型病毒性肝炎抗体间接ELISA检测方法的建立以纯化的VP0截短蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鸭IgY为酶标二抗,建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗体的间接ELISA方法。通过优化各种条件,最终确定VP0截短蛋白最佳包被浓度为2μg/mL,鸭血清最佳稀释度为1：320,HRP标记的兔抗鸭IgY最佳稀释度为1：4000,该方法特异性强、敏感性高、重复性好。3.VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体的制备以纯化的鸭甲型肝炎病毒VP0、VP1截短基因的重组蛋白为免疫原,四次免疫体重约2.5kg的白兔。效价较高时颈动脉采血,收集并纯化血清,制备抗VP0、VP1截短蛋白多克隆抗体。以纯化的DHAV为包被抗原,用间接ELISA检测VP0、VP1截短蛋白多抗的效价,结果显示抗VP0截短蛋白多抗的效价为51200,抗VP1截短蛋白多抗的效价为12800。4.鸭甲型病毒性肝炎抗原夹心ELISA检测方法的建立以纯化的VP0截短蛋白多抗为包被抗体,以鸭多抗为检测抗体,建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗原的夹心ELISA方法。通过对各级条件的优化,确定VP0截短蛋白多抗最佳包被稀释度为1：16000,鸭多抗最佳稀释度为1：200,HRP标记的兔抗鸭IgY最佳稀释度为1：3000。由试验结果可知该方法重复性好、特异性强。综上可知,本研究通过筛选VP0、VP1基因的亲水强的优势抗原区,成功表达了抗原性强的VP0、VP1截短蛋白,制备了抗VP0、VP1截短蛋白的兔多抗,并建立了检测鸭甲型病毒性肝炎抗原抗体的特异性强、重复性好的快速ELISA检测方法,这对该病的诊治和预防有重要意义。
【作者】刘帅帅；
【导师】张万坡；
【作者基本信息】华中农业大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】DHAV；VPO/VP1截短基因；截短蛋白；间接ELISA方法；夹心ELISA方法；

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