柑橘裂皮病毒侵染对寄主基因表达的影响研究

【摘要】柑橘裂皮类病毒(Citrusexocortisviroid,CEVd)是对柑橘生产造成危害的主要致病因子,导致植株矮化、树茎减少、裂皮、树势衰弱和大量落花落果,严重减产,给柑橘生产带来了严重的经济损失。本研究采用基因芯片技术分析了CEVd强毒株系对柑橘基因表达谱的影响,探究CEVd与柑橘互作过程所影响到的相关基因,为明确其致病机理奠定基础。主要结果如下：1、以具有强毒株系特征的CEVd分子变种CEVd.01为试材,将其二聚体化后进行体外转录,机械接种至以枳壳为砧木的香橼861嫩芽上,接种3个月后进行RT-PCR检测验证及症状观察。RT-PCR检测结果表明接种样品ZK1、ZK2和ZK3的枳壳苗均获得了预期大小的目标片段,而阴性样品CK1、CK2和CK3枳壳苗未检测出目标片段。将检测得到的目标片段进行回收克隆并测序,确证CEVd.01接种成功。2、接种成功后,选取阴性对照植株CK1、接种阳性植株ZK1和分离物CEVd.01的毒源植株CK+进行差异表达分析。分别选取三个时间点,每个时间点相隔31天收集枳壳苗叶片,收集叶片时对上中下部的叶片同时收集混合在一起送交公司进行基因芯片分析。结果显示CEVd侵染后引起枳壳基因表达水平的显著改变,而毒源材料相关基因的表达改变水平明显强于接种材料；其中上调基因主要涉及植物防御信号途径相关基因；下调基因主要包括糖类(纤维、果胶、木糖等)、蛋白(微管蛋白、伸展蛋白、成束蛋白等)、激素(乙烯、赤霉素和烟酰胺)、细胞色素、氧化还原酶、过氧化物酶和几丁质酶等代谢相关基因。3、选取从功能上与植株生长和细胞壁合成相关的5个显著下调的基因作为候选基因,包括木糖苷酶(Glycometabolism)、果胶酯酶(Pectinesterase)、乙烯响应元件结合因子(ERF-likeprotein)、烟酰胺合酶基因NAS(Nicotianaminesynthase1)以及聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase),间隔31天分3个时间点收集材料,以18sRNA为内参采用半定量RT-PCR进行时空表达的验证分析。其中乙烯响应元件结合因子、烟酰胺合酶基因NAS、聚半乳糖醛酸酶这3个基因在三个时间点CK+和ZK1相对于CK1均呈现下调表达,而木糖苷酶、果胶酯酶在前两个时间点CK+和ZK1相对于CK1呈现下调表达。从半定量PCR的结果可以看出,基因芯片的实验材料CK+相对于CK1的验证结果与采用基因芯片分析结果基本一致。
【作者】李焕楠；
【导师】徐文兴；
【作者基本信息】华中农业大学，植物病理学，2014，硕士
【关键词】柑橘；类病毒；柑橘裂皮类病毒；病原与寄主互作；基因芯片；表达动态分析；

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