LPS和沙门氏菌刺激时鸡脑内TLR4的表达规律研究

【摘要】由于血脑屏障(BloodBrainBarrier,BBB)的存在,中枢神经系统(CentralNervousSystem,CNS)被认为是免疫特免区,CNS内炎症感染与免疫反应一直以来都备受关注和争议。Toll样受体(Tolllikereceptors,TLRs)的发现促进了人们对脑内炎症反应机制的认识,吸引了众多研究者的目光。TLR4是第一个被发现的TLRs,广泛分布于机体的组织细胞。有研究表明TLR4在哺乳动物CNS内胶质细胞上表达,并证实在炎症过程中,胶质细胞通过TLR4与配体结合而发挥作用。目前有关TLR4与家禽脑内炎症和免疫反应的关系缺乏系统研究报道。因此,本项目拟以2日龄雏鸡作为试验对象,研究脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和沙门氏菌刺激对脑组织结构和BBB超微结构的影响,同时检测鸡脑组织内TLR4的分布特征以及表达变化,为揭示脑内天然免疫反应机制奠定基础。主要研究内容和结果如下：1.LPS和沙门氏菌刺激对脑组织结构的影响本试验采用LPS和沙门氏菌腹腔注射2日龄雏鸡,探究细菌及其产物外周刺激后,脑组织结构的变化。结果显示：与对照组相比,LPS刺激后,随着时间的延长,小脑软脑膜下血管扩张、充血,软脑膜肿胀、增厚,以及浦肯野细胞层处微血管玻璃样变。沙门氏菌刺激后,小脑软脑膜下血管充血,炎性细胞浸润,血管阻塞,血管周围炎性细胞浸润,到后期,可见脑膜充血、水肿、出血,以及神经元坏死呈空泡状。与对照组相比,LPS刺激后,可见大脑软脑膜下血管充血、肿胀,软脑膜增厚,炎性物质渗出,炎性细胞增多以及组织坏死。沙门氏菌后,大脑软脑膜增厚、软脑膜下血管扩张、充血,同时在大脑皮质,可见微血管扩张、炎性细胞增加和组织坏死。以上结果提示外周注射LPS和沙门氏菌能够引起CNS内脑组织一定程度的组织结构改变和病理变化。2.沙门氏菌刺激对血脑屏障超微结构的影响采用电子显微镜研究沙门氏菌刺激对鸡脑内血脑屏障超微结构的影响。结果显示：生理盐水组微血管壁及其周围神经纤维网结构完整。沙门氏菌刺激12h后,微血管内皮细胞核溶解,内皮细胞骨架形态改变,细胞膜扩张。72h后,微血管周围神经纤维网退化,细胞突起消失以及神经元轴突和树突退化。研究结果提示外周微生物感染可能通过改变BBB的结构进而影响其相关功能和CNS内环境的稳定性。3.TLR4在鸡脑组织内的分布特征采用免疫组化染色法研究TLR4在2日龄鸡脑内的分布特征。结果显示：TLR4在2日龄鸡脑内呈组成型表达,且具有一定分布规律,主要分布在大脑的软脑膜、微血管壁和神经元以及小脑的软脑膜、浦肯野细胞以及髓质神经元,微血管壁呈现弱表达。以上研究结果表明,在正常发育条件下,鸡CNS内存在固有免疫受体TLR4,可能参与外源性刺激的识别和应答反应。同时,固有免疫的识别和启动可能不仅依赖于软脑膜和循环血流,还可能依赖于脑实质内神经元上相关免疫因子的作用。4.LPS和沙门氏菌刺激对鸡脑内免疫因子表达的影响本研究采用LPS和沙门氏菌外周刺激2日龄雏鸡,分别于刺激后0h、12h、36h和72h取组织样,采用夹心ELISA的方法检测LPS和沙门氏菌刺激后不同时间点脑内TLR4的表达水平。结果显示：大脑内,LPS和沙门氏菌刺激后,TLR4在大脑内呈先降低后升高,36h时均下降到最低值。与大脑相反的是,LPS和沙门氏菌刺激后,TLR4在小脑内呈先升高后降低的趋势,12h时达到最大值。这一结论提示,大脑和小脑对病原体外周刺激的应答反应时间可能有所不同,并且TLR4识别病原物从而被诱导表达的机制可能存在差异。采用夹心ELISA的方法检测LPS和沙门氏菌刺激后不同时间点脑内Iba-1的表达水平变化,结果发现：在大脑内,LPS刺激后,Iba-1的表达水平升高,在12h达到最大值。沙门氏菌刺激后,Iba-1的表达亦为升高的趋势,36h时达到最大值。与大脑不同的是,在小脑内,LPS和沙门氏菌刺激后,Iba-1表达降低。这一结果提示LPS和沙门氏菌均能够活化大脑内的小胶质细胞。采用夹心ELISA的方法检测LPS和沙门氏菌刺激后不同时间点脑内E选择素的表达水平变化,结果发现：在大脑内,LPS刺激后,E选择素的表达呈下降趋势。沙门氏菌刺激后,E选择素在短时间内表达水平降低,并在36h时下降到最低值。在小脑内,LPS和沙门氏菌刺激对E选择素表达水平的影响不显著。这一结果表面沙门氏菌对脑内微血管的影响可能需在刺激时间延长后进一步分析。采用夹心ELISA的方法检测LPS和沙门氏菌刺激后不同时间点脑内钙卫蛋白的表达水平变化,结果发现：在大脑内,LPS和沙门氏菌刺激后,钙卫蛋白的表达水平先升高后降低,在12h时显著高于对照组水平,在72h时显著低于对照组水平。与大脑相反的是,在小脑内,LPS刺激后,钙卫蛋白表达水平降低,在72h下降到最低值。沙门氏菌刺激后,钙卫蛋白的表达先降低后升高,在36h达到最大值,与对照组相比差异显著。这一结果说明CNS内大脑可能是炎症感染发生的主要部位。
【作者】温乐；
【导师】刘华珍；
【作者基本信息】华中农业大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】鸡；中枢神经系统；天然免疫；TLR4；LPS；沙门氏菌；

【参考文献】
[1]张自驰,张国钢,耿英三,姚建军,雷冠华,王建华.磁传感器阵列测量大电流的传感器拓扑问题研究[J].电力系统自动化,2007,23:74-78.
[2]寇荷花.鳙鱼蛋白粉加工工艺研究[D].扬州大学,农产品加工及贮藏工程,2011,硕士.
[3]周俊.热源厂房不同通风方式的比较研究[D].东华大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2013,硕士.
[4]杨爽风.异穿心莲内酯衍生物的合成[D].天津医科大学,药物化学,2009,硕士.
[5]王玉峰,李立伟,邹积岩,廖敏夫,李洪春.纳秒级上升时间的高压脉冲群电源[J].电力系统自动化,2006,22:96-100.
[6]潘凯岩,王建勇,朱锦峰,车方毅,万磊.随州地调系统潮流模拟操作的实用化处理[J].电力系统自动化,2006,03:102-104.
[7]杨晨.长春市人口老龄化及其与经济发展的协调性研究[D].吉林大学,人口资源与环境经济学,2014,硕士.
[8]何智慧.资源型企业多元化经营的行业选择研究[D].内蒙古大学,企业管理,2014,硕士.
[9]刘秀敏.Ge纳米薄膜电输运性质与Si基纳米材料热电性能研究[D].河北师范大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[10]万岩,彭涛,张敏.分析型CRM在电信企业的应用[J].邮电企业管理,2002,03:49-51.
[11]徐佩.风力发电机塔架结构动力安全性分析[D].哈尔滨工业大学,结构工程,2013,硕士.
[12]汤明璐.急诊室缺血性脑卒中患者急性期血压变化规律及影响因素的前瞻性研究[D].山东大学,神经病学（专业学位）,2013,硕士.
[13]马行.不同抽吸时段对颗粒脂肪细胞活性的影响[D].华中科技大学,整形外科,2013,硕士.
[14].黄荷凤教授[J].生殖与避孕,2014,03:174.
[15]杨斌鑫,欧阳洁,周文,王芳,栗雪娟.同心旋转圆柱间隙流场中纤维取向的动态模拟[J].物理学报.
[16]赵豫东.张太雷青年运动思想研究[D].内蒙古师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[17]王小君,巩超,和敬涵.考虑频率波动的改进瞬时电压d-q分解算法[J].北京交通大学学报,2014,05:128-131.
[18]谭冬梅.小鼠囊胚体外着床三维模型的建立[D].重庆医科大学,生物医学工程,2004,硕士.
[19]周亭.新型两亲分子/DNA复合物的制备与性能研究[D].山东大学,化学,2014,博士.
[20]孙瑞宁.基于线激光的沥青路面构造深度检测系统[D].长安大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[21]陈胜军.县域金融萎缩问题及对策研究[D].西南农业大学,金融学,2004,硕士.
[22]姜皓.大学生责任教育探析[D].吉林大学,思想政治教育,2013,硕士.
[23]汪晶.化学法对皮革化学品可生化性的影响[D].陕西科技大学,环境工程,2013,硕士.
[24]王真.基于典型物料透气阀袋包装技术研究[D].江南大学,包装工程,2012,硕士.
[25]格日乐.民间信仰、民族认同及其社会性解释[D].内蒙古师范大学,社会学,2012,硕士.
[26]李磊,曹志强,侯增广,谭民.基于行为的轮式移动机器人导航控制[J].控制与决策,2004,06:707-710.
[27]徐颖倩.一种模拟血管微环境的药物筛选模型的设计及实验研究[D].重庆大学,生物制药工程,2014,硕士.
[28]郑亮.黑龙江省奶牛养殖组织化程度研究[D].东北农业大学,农业经济管理,2013,硕士.
[29]丁欣.房地产企业多元化融资模式研究[D].华东理工大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[30]许华建,蔄秋石,林义成,李源源,冯乙巳.铜催化碳杂偶联反应的新进展[J].有机化学,2010,01:9-22.
[31]肖春旺,周广胜.不同浇水量对毛乌素沙地沙柳幼苗气体交换过程及其光化学效率的影响[J].植物生态学报,2001,04:444-450.
[32]高鹏.“泥土”的媒介价值研究[D].中央美术学院,美术学,2013,硕士.
[33]冯晓婷.后金融危机背景下碳排放权交易法律制度研究[D].北方工业大学,法学,2013,硕士.
[34]祝蕾.碳点的合成、表征、功能化及其在荧光免疫分析中的应用[D].辽宁师范大学,2014.
[35]刘玲梅,孔志周.数据挖掘在销售预测中的应用[J].商业时代,2004,17:8-9.
[36]胡泽民.“学习用户”理念下远程高等教育教学运行模式研究[D].厦门大学,2005.
[37]张睿刚.超高膨胀比涡轮机气动性能研究[D].哈尔滨工业大学,动力工程,2014,硕士.
[38]魏然.大堂鼓、排鼓演奏手法探究[D].中央音乐学院,中国打击乐,2012,硕士.
[39]李继东.协同式工艺信息系统研究与应用[D].西北工业大学,机械制造及其自动化,2004,硕士.
[40]张彤雷.企业高级管理人员劳动者身份质疑[D].吉林大学,经济法学,2014,硕士.
[41]杨运,任菊秋.饲料级氧化锌表面改性研究[J].饲料工业.2008(10)
[42]李文红.基于Web Services的图书检索系统设计与实现[D].河北科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[43]黄美玲.LAIR-1在免疫性血小板减少症患儿的表达研究[D].遵义医学院,儿科学,2014,硕士.
[44]王锋.山东能源集团企业文化整合研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[45]李学鑫.柑桔ROP小G蛋白基因家族的表达谱分析[D].西南大学,植物学,2013,硕士.
[46]黄欣,白雪,秦琴,王超凡,张琪.二氧化钛-石墨烯纳米材料修饰电极在水环境检测中的应用研究[A].中国环境科学学会.2014中国环境科学学会学术年会（第四章）[C].中国环境科学学会:,2014:3.
[47]杨波.益阳花鼓戏的艺术风格与表演特征的探究[D].湖南师范大学,音乐学,2014,硕士.
[48]杨柳.宁夏劳务移民社会适应研究[D].宁夏大学,农业经济学,2014,硕士.
[49]苏洪梅.侨捐项目监管体系研究[D].华侨大学,公共管理（专业学位）,2014,硕士.
[50]孙晨.Dy掺杂的BiFeO_3陶瓷的铁电—顺电相变[D].南京理工大学,材料工程,2013,硕士.