猪流行性腹泻病毒细胞培养适应的初步研究

猪流行性腹泻病毒细胞培养适应的初步研究

作者:师大云端图书馆 时间:2016-06-03 分类:硕士论文 喜欢:1283
师大云端图书馆

【摘要】冠状病毒在系统分类上属尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。它是有包膜的单股正链RNA病毒,在细胞质中复制。经历过2003年中国爆发的SARS,人们开始对冠状病毒广泛关注。2013年中东国家和地区爆发一种新型冠状病毒MERS-CoV引起的SARS病症,患者死亡率高达50%,再一次引起世人对冠状病毒的广泛关注。而PEDV属于α类冠状病毒,只有一个血清型。2010年我国境内爆发猪流行腹泻病毒(下文简称为PEDV),它的基因组包括ORF1a/b-S-ORF3-E-M-N,基因ORF1a/b和ORF3分别编码复制酶多聚蛋白和附属蛋白两个非结构蛋白,而基因S、E、M和N分别编码纤突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。PEDV的细胞嗜性主要是由Spike蛋白(即S蛋白)决定的,同时S蛋白的S1区也包含了病毒主要的中和表位。PEDV的受体是pAPN,pAPN是150kDa的糖基化的跨膜蛋白,在小肠粘膜上高表达。PEDV的S蛋白是高度糖基化的,含有21-35个N糖基化位点。S蛋白在病毒表面上组装成三聚体形成明显的“冠”。大多数研究都把S蛋白划分成S1区和S2区,S1区域包含受体结合域(RBD),S2区域含有两个七肽重复区(HR1和HR2),认为S1区域负责与细胞受体结合,而S2区域负责膜融合。冠状病毒进入细胞也有自己的一套机制,早在2003年Bosch等人就鉴定了冠状病毒的S蛋白为Ⅰ型融合蛋白,2008年JudithM.White等人按照结构的标准确定了三种明显不同的病毒膜融合蛋白(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型融合蛋白),以及至少四种不同的激发病毒融合蛋白经历融合而导致构象变化的机制,总结了各种特征的病毒融合蛋白经历“完全融合状态→嵌膜的同源三聚体发卡前体→三聚体发夹”的转化,从而促进病毒膜与宿主细胞膜的融合,而冠状病毒的S蛋白也同样通过这种策略调节融合。PEDV的细胞培养比较困难,目前学界得到的PEDV细胞培养株只有7株,而且这些毒株适应Vero细胞的分子基础尚不得而知,一些初步的研究结果提示S基因碱基或氨基酸的突变可能是潜在的PEDV适应细胞的关键分子基础。2013年,我们课题组与荷兰乌德勒支大学兽医学院合作,利用PEDV与MHV间S基因胞外区的替换,成功构建了基于RNATargetedrecombination方法的PEDV反向遗传学操作平台,为本课题的顺利实施奠定了坚实的基础。因此,本论文利用该操作系统,用DR13毒株非细胞适应株(Genbank:JQ023161)的S基因,分别逐段替换DR13细胞适应株(Genbank:JQ023162)的对应S基因区段,得到一组嵌合S基因重组病毒。通过观察重组病毒细胞适应性的改变,最终阐明PEDV适应Vero细胞的关键基序或位点,为PEDV的细胞适应改造工作提供直接的操作靶点,彻底解决PEDV的细胞培养难题。
【作者】张攀;
【导师】孟清;李震;
【作者基本信息】东华大学,生物工程(专业学位),2014,硕士
【关键词】PEDV;S蛋白;受体;融合蛋白;细胞适应;反向遗传学;

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