Bacillus amyloliquefaciens M1菌株生产的抗菌脂肽对耐药性海洋病原弧菌抑菌活性的研究

【摘要】解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）在其生长过程中能产生多种脂肽类物质，具有显著的抗细菌、抗真菌和抗支原体活性。抗菌脂肽是由脂肪酸链和肽链两部分构成，兼具亲水性和疏水性，这类物质种类多样，结构各异。抗菌脂肽在农业生物防治、医药和环境治理等多个领域内具有巨大的应用潜力。抗菌脂肽具有广泛的抑菌活性，但是否对海洋病原弧菌有抑制作用呢？海洋动物弧菌病会对海水养殖造成重大的经济损失。目前主要通过使用抗生素来防治海洋动物弧菌性疾病，但抗生素容易使海洋环境中的微生物产生耐药性，破坏海洋菌群的平衡。所以亟需寻找一种能杀死耐药性病原弧菌的，天然且安全的抑菌物质来防治海洋动物的弧菌性疾病。本研究中，M1菌株是一株分离自红树林的菌株，其次级代谢产物具有较强的抑菌活性。利用常规方法和分子生物学方法对M1菌株进行鉴定，该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens），这是一株在实际应用中比较安全的细菌。M1菌株可以对9种常见的具有耐药性的海洋病原弧菌产生抑菌活力。为了降低M1菌株产抑菌物质的生产成本，利用廉价原料优化了发酵培养基。最佳发酵条件为：豆饼粉1.0%(w/v)，面粉1.5%(w/v)，pH7.0，培养温度为28℃，180rpm振荡培养24h。完成了M1菌株在10-L发酵罐中的发酵实验，M1菌株在发酵培养21h时进入生长稳定期，菌体量达到1.6×109cells/mL，在第18h时抑菌活力最大，抑菌圈直径为34.0mm、并测定了淀粉酶活力（最高为48.7U/mL）和蛋白酶活力（最高为2.3U/mL）随时间变化规律。通过酸沉淀、甲醇抽提，薄层层析和高效液相色谱法（HPLC）等手段对发酵上清液中的抑菌物质进行了分离和纯化，获得了抑菌物质NQ。质谱分析表明，抑菌物质NQ是表面活性素（surfactin），由Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu分别连接C12、C13、C14和C15的β-羟基脂肪酸构成的环状脂肽。纯化后的抗菌脂肽NQ最适作用温度是28℃，在20℃-40℃之间都有良好的稳定性；在pH7.0-9.0之间抗菌脂肽的稳定性较好，其最小抑菌浓度为12.5μg/mL。对M1菌株纯化后的抗菌脂肽的抑菌机理进行初步探究：纯化后的抗菌脂肽不仅可以杀死完整的鳗弧菌细胞，还能杀死鳗弧菌细胞的原生质体，这说明抗菌脂肽可能是通过破坏细胞膜来杀死细菌的。电镜检测发现，被抗菌脂肽作用过的鳗弧菌细胞表面出现破损，细胞出现降解，细胞内容物释放，导致细胞死亡，说明抗菌脂肽能破坏鳗弧菌细胞表面结构。荧光检测发现抗菌脂肽作用过的鳗弧菌细胞可以被染料PI染色，进一步证明抗菌脂肽能破坏细胞膜结构，改变细胞通透性，破坏细胞的完整性，进而杀死整个细胞。
【作者】徐红梅；
【导师】池振明；
【作者基本信息】中国海洋大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】解淀粉芽孢杆菌；脂肽；耐药性；病原弧菌；抑菌机理；

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