盐酸小檗碱对乳腺癌细胞的生长抑制作用及其机制研究

【摘要】研究背景乳腺癌是女性中最常发生的恶性肿瘤，是导致女性癌症死亡的首要原因。据世界卫生组织统计，在2008年中，大约有138万人被诊断为乳腺癌，占女性癌症患者的23%。包括中国在内的大多数亚洲国家，以前是乳腺癌的低发区，但近年来乳腺癌的发病率亦逐年升高，特别是在一些经济发达的地区和城市，且有年轻化倾向。因此，对于乳腺癌的防治研究具有深远意义。随着对乳腺癌发病机制研究的深入，乳腺癌综合治疗水平得到很大提高。近年来，乳腺癌局部手术治疗、放化疗、内分泌治疗、分子靶向试剂以及传统中医中药的辅助治疗的多种治疗方式，明显改善了患者的生存质量，延长了生存期。传统中医药药物资源丰富，许多中药或中药提取物都具有抗肿瘤活性，但是长期以来，中医药在乳腺癌综合治疗中的地位不高。所以，探讨中医药在乳腺癌综合治疗中的靶点和机理，一直是乳腺癌防治研究的重要课题。小檗碱，又名黄连素，是一种常见的异喹啉类生物碱，临床上主要用于肠道感染的治疗。随着近年研究的深入，人们发现小檗碱在免疫调节、治疗心血管疾病、抗高血脂以及防治癌症等方面有广泛的药理作用。目前的研究发现，小檗碱可以通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等方式，发挥其对乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肠癌、黑色素瘤和神经胶质瘤等肿瘤细胞的增殖抑制作用。有研究报道，小檗碱可以通过诱导乳腺癌细胞发生细胞周期阻滞和凋亡，抑制乳腺癌细胞增殖，但是目前具体的机制研究并不深入和完善。这就使得小檗碱的临床研究缺乏理论基础，阻碍了该药物的广泛开发。在本实验中，我们主要研究了小檗碱对乳腺癌细胞的生长抑制作用及其可能的相关机制，探讨了小檗碱与他莫昔芬的协同抗乳腺癌细胞增殖作用，揭示小檗碱抗乳腺癌作用的新靶点，完善小檗碱抗乳腺癌作用和协同他莫昔芬抑癌作用的相关机制，为临床应用小檗碱治疗乳腺癌奠定理论基础。第一部分转录本芯片筛选乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中受小檗碱调控的基因实验目的：探讨小檗碱对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，采用转录本芯片的方法筛选这两种细胞中受小檗碱调控的基因。实验方法：1.首先应用MTS方法检测小檗碱对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖的影响；2.应用细胞克隆形成实验检测小檗碱对MCF-7和MDA-MB-231细胞克隆形成能力的影响；3.应用流式细胞仪检测小檗碱对MCF-7和MDA-MB-231细胞周期的影响；4.应用流式细胞仪检测小檗碱对MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡的影响；5.应用安捷伦转录本芯片的方法筛选MCF-7和MDA-MB-231细胞中受小檗碱调控的靶基因；6.通过Real-timePCR的方法验证芯片结果。实验结果：1.小檗碱呈剂量依赖性地抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖；2.小檗碱显著抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞克隆形成；3.小檗碱诱导MCF-7细胞发生G1期阻滞，但是对MDA-MB-231细胞周期调控并不显著；4.小檗碱诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡；5.对芯片结果采用GO数据库进行基因功能分析，结果证实小檗碱调控的基因主要包括调控细胞迁移、细胞周期、细胞凋亡和药物反应等方面；6.从芯片结果中选取10个基因进行Real-timePCR验证，结果显示，尽管同一个基因在芯片结果和Real-timePCR结果中受小檗碱调控改变的具体倍数有一定差异性，但是改变的趋势是一致的，证明芯片结果是可靠的。同时，在MCF-7细胞中，小檗碱可以显著诱导CYP1A1表达，因此，CYP1A1作为一个候选基因，将在第二部分做具体分析。实验结论：1.小檗碱呈剂量依赖性地抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖；2.小檗碱可以诱导MCF-7细胞发生G1期阻滞，诱导MCF-7和MDA-MB-231细胞凋亡；3.转录本芯片技术是一种有效的高通量筛选靶基因的方法。通过初步的转录本芯片分析，我们认为小檗碱抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖可能与小檗碱参与调控这两种细胞中的细胞凋亡、细胞周期和药物反应通路的基因有关。第二部分小檗碱对MCF-7细胞中CYP1A1/CYP1B1的影响实验目的：在乳腺癌MCF-7细胞中，探讨小檗碱对乳腺中主要的雌激素代谢酶CYP1A1和CYP1B1表达的影响。实验方法：1.应用Real-timePCR检测不同浓度和不同时间的小檗碱处理后对MCF-7细胞中CYP1A1和CYP1B1的mRNA表达水平的影响；2.应用Westernblot检测不同浓度和不同时间的小檗碱处理后对MCF-7细胞中CYP1A1和CYP1B1蛋白表达水平的影响。实验结果：1.小檗碱可以显著诱导MCF-7细胞中CYP1A1的mRNA表达，并且这种诱导具有时间和剂量依赖性；小檗碱对MCF-7细胞中的CYP1B1的mRNA表达也具有一定的诱导作用，但并不具有时间剂量依赖性；2.小檗碱可以显著诱导MCF-7细胞中CYP1A1蛋白水平表达增加，但是小檗碱对MCF-7细胞中CYP1B1蛋白表达没有显著影响；3.在MCF-7中，小檗碱对CYP1A1的诱导作用高于对CYP1B1的诱导作用。实验结论：1.BBR可以显著诱导CYP1A1的mRNA和蛋白表达；2.BBR对CYP1B1的mRNA表达有一定的诱导作用，但是对CYP1B1蛋白表达没有显著影响；3.BBR对MCF-7细胞中CYP1A1的诱导强度大于对CYP1B1的诱导。第三部分小檗碱与他莫昔芬协同抗乳腺癌MCF-7和MCF-7/TAM细胞增殖作用的研究实验目的：研究了小檗碱联合他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞的协同抑制作用，并对可能的机制进行了一定的探讨。实验方法：1.基于高剂量冲击诱导两阶段筛选法持续诱导乳腺癌他莫昔芬耐药细胞株MCF-7/TAM，并用MTS方法进行他莫昔芬耐药鉴定；2.应用MTS方法，检测小檗碱对MCF-7和MCF-7/TAM细胞增殖的影响；3.应用MTS方法，探讨小檗碱联合他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞增殖的影响；4.应用流式细胞仪分析，检测小檗碱联合他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞周期的影响；5.应用流式细胞仪分析，检测小檗碱联合他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞凋亡的影响；6.应用Westernblot方法，检测小檗碱联合他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞中相关周期凋亡蛋白的影响。实验结果：1.MCF-7/TAM细胞对他莫昔芬的耐受性高于MCF-7细胞，MCF-7/TAM细胞构建成功；2.小檗碱时间剂量依赖性地抑制MCF-7和MCF-7/TAM细胞增殖；3.小檗碱联合他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞增殖抑制作用强于相同剂量的他莫昔芬单药作用组；4.小檗碱联合他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞的周期阻滞作用强于相同剂量的他莫昔芬单药作用组；5.小檗碱联合他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞的促凋亡作用强于相同剂量的他莫昔芬单药作用组；6.小檗碱可以增强他莫昔芬对MCF-7和MCF-7/TAM细胞中相关周期蛋白的调控，这可能是小檗碱增强他莫昔芬药效的机制之一。实验结论：1.小檗碱可以显著增强MCF-7和MCF-7/TAM细胞对他莫昔芬的敏感性；2.小檗碱可以时间剂量依赖性地抑制MCF-7和MCF-7/TAM细胞增殖；3.小檗碱可以协同他莫昔芬诱导MCF-7和MCF-7/TAM细胞发生G1阻滞；4.小檗碱可以协同他莫昔芬诱导MCF-7和MCF-7/TAM细胞发生细胞凋亡；5.小檗碱可以增强他莫昔芬对P21的诱导作用，可能与诱导G1期阻滞相关；同时小檗碱联合他莫昔芬可以上调Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白，降低Bcl-2/Bax比例，这可能与诱导细胞凋亡相关。
【作者】温纯洁；
【导师】周宏灏；
【作者基本信息】重庆医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】小檗碱；乳腺癌；他莫昔芬；周期；凋亡；

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