腐败希瓦氏菌噬菌体Spp001基因序列及其裂解活性研究

【摘要】腐败希瓦氏菌被认定为冷藏鲜鱼的特定优势腐败菌，是导致鱼制品的腐败重要因素，因此通过控制腐败希瓦氏菌生长可以延长鱼类食品货架期。内溶素是噬菌体繁殖后期释放子代过程中编码的一类蛋白，能够水解宿主菌细胞壁。内溶素因其高效裂解宿主菌和专一性作用宿主菌已经应用到各个领域中，包括食品保藏。目前传统的保鲜方法中还没有既能专门作用特定腐败菌又能保持产品品质的方法。内溶素有望作为新型生物保鲜剂用于防止细菌感染和控制细菌的生长。前期工作已经证明，噬菌体Spp001用于冷藏牙鲆鱼肉的防腐中可以有效延长鱼类货架期并表现出其应用潜力。为了更深入的认识与噬菌体Spp001裂解性能，本研究在基因水平上，通过对噬菌体Spp001全序列分析，寻找与裂解有关的蛋白，推测其裂解机制，并且建立了共沉法提取含有内溶素的粗酶液的方法及相应的检测方法，分析并验证其裂解活性，测定其酶学性质。本文首次报道了一株新型腐败希瓦氏菌噬菌体Spp001全序列基因信息，噬菌体Spp001的宿主菌为腐败希瓦氏菌Sp225。噬菌体Spp001的基因是双链DNA分子，由54,789-bp组成，一共含有67个开放阅读框，G+C的平均含量为49.42%。通过生物信息学方法分析，对噬菌体Spp001全序列基因进行功能注释。对噬菌体有关裂解基因着重分析，没有找到明确编码穴蛋白的基因，最可能编码内溶素的基因为ORF62。综合分析结果Spp001裂解机制可能是依靠内溶素单独起作用，而不是和孔蛋白共同起作用。为了确定噬菌体Spp001的裂解活性，通过共沉法提取噬菌体Spp001裂解液，并利用浊度法和扩散法分析裂解液的活性。结果表明裂解液中含有内溶素，可使OD590在15min内下降0.160，其底物菌体并未经过任何处理。横向比较裂解液、噬菌体、溶菌酶与死菌、活菌、细胞壁肽聚糖作用15min的裂解效果，结果表明噬菌体Spp001裂解液裂解细胞壁的活性较好，并且能在较短的时间（5min）内发挥作用。通过测定碱性磷酸酶（AKP）含量变化和分析透射电镜图片，得出裂解液可导致菌体细胞壁甚至细胞膜破裂。本研究后期分析噬菌体Spp001裂解液反应最适条件，结果表明：裂解液在pH6-8的范围具有较高的酶活力，最适pH为7。在20-30°C下，有较高的酶活力，最适反应温度为30°C。对浊度法测定酶活条件优化后，可使酶活从160U/mL提高到380U/mL。同时得出裂解液不需要金属离子保持活力并且有一定的耐盐性和耐热，50°C温育24h仍可以测到酶活。另外利用外膜通透剂（0.1%Triton-X-100）处理的菌体基底，辅助裂解液更好的发挥裂解效果，酶活进一步提高至404U/mL。裂解液在4°C下保存9天后失活，-80°C下则损失73.3%。本研究证明Spp001是一株新型腐败希瓦氏菌噬菌体，能够高效表达强裂解活性的内溶素。同时为噬菌体Spp001内溶素的纯化提供理论基础，为扩大Spp001应用范围提供可能性。
【作者】韩峰；
【导师】王静雪；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产品加工及贮藏工程，2014，硕士
【关键词】腐败希瓦氏菌；噬菌体全序列；裂解酶；裂解活性；

【参考文献】
[1]王福恩.上海地铁M8线黄兴路车站深基坑综合施工技术研究[D].西南交通大学,2003.
[2]杜克.基于双目图像的2D-3D图像转换方法研究[D].哈尔滨工业大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[3]王小毛.二苯甲酮合成技术及清洁生产研究[D].重庆大学,环境工程,2003,硕士.
[4]夏雪宝.螺栓结合面建模方法及电机振动噪声预测研究[D].武汉理工大学,轮机工程,2012,硕士.
[5]烛兰其其格.巴尔虎史诗发展阶段问题研究[D].内蒙古大学,中国少数民族语言文学,2014,硕士.
[6]陈艺文.公共租赁住房的户型范式研究[D].西安建筑科技大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[7]张尔桂.义务教育均衡发展问题研究[D].安徽大学,公共管理,2012,硕士.
[8]陶星月.长序列实值离散Gabor变换窗函数双正交关系式及快速求解算法[D].安徽大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[9]田勇,唐祯安,喻言.室内无线传感器网络信道传输模型及统计分析[J].控制与决策,2014,06:1135-1138.
[10]陈超.卢梭现代性批判思想研究[D].中共中央党校,外国哲学,2013,硕士.
[11]鲁利.马克思主义分配正义理论及其当代实践[D].湖南师范大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[12]韩臻,黎琳,何永忠.美国信息安全教育和人才培养措施借鉴[J].保密科学技术,2014,07:4-9+1.
[13]卢维天.写实油画与中国画空间意识的差异[D].西北民族大学,美术学,2012,硕士.
[14]要丹.石油地质实验信息自动管理与评价系统[D].吉林大学,2008.
[15]高小霞.互联网行业相关市场界定法律问题研究[D].兰州商学院,经济法学,2014,硕士.
[16]郝萌萌.黄芪对小鼠胰岛炎及胰岛β细胞凋亡的保护作用[D].青岛大学,儿科学,2013,硕士.
[17]高天号,陆雪梅,徐炎华.Fenton+水解酸化-好氧生化组合工艺处理液晶显示屏清洗废水[J].水处理技术,2015,03:99-102.
[18]陈敏.我国商品房预售登记制度研究[D].华中师范大学,法律,2013,硕士.
[19]刘立志,蒋玉珍.一种新的智能模糊控制算法及其应用[J].控制与决策,1995,01:93-96.
[20]程松梅.DF公司推进方针管理的策略研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[21]吕作涵.分数阶控制器在伺服系统中的应用研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[22]尹甜甜.高职院校学生婚恋观教育研究[D].华东师范大学,思想政治教育,2012,硕士.
[23]王南松.数据库的法律保护[D].华东政法学院,国际法,2004,硕士.
[24]陈肖娟.城镇地下水污染防治法律制度研究[D].厦门大学,环境与资源保护法学,2014,硕士.
[25]原璇璇.耗能支撑对钢管混凝土结构的减震分析[D].河北工程大学,结构工程,2012,硕士.
[26]何凤琴.棕色田鼠（Microtus mandarinus）和沼泽田鼠（M.fostis）性激素及其受体和Fos在脑内的表达与社会行为的关系[D].陕西师范大学,动物学,2004,硕士.
[27]庄君霞.过渡金属氧化物电极材料的制备及其超级电容性能的研究[D].兰州理工大学,应用化学,2014,硕士.
[28]相大磊.《逸周书》副词研究[D].安徽大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[29]张晓玮.中、港、美证券市场间的交叉相关研究[D].华中科技大学,金融学,2012,硕士.
[30]毕旭.公共政策制定的利益博弈分析[D].苏州大学,行政管理,2013,硕士.
[31]杨名.论《鹿特丹规则》下的批量合同及其对我国的影响[D].大连海事大学,法学,2013,硕士.
[32]李岳霖.可重构系统中基于MMU的软硬件通信机制的研究与实现[D].东北大学,计算机软件与理论,2009,硕士.
[33]朱军.论我国法官助理制度的建立与完善[D].中国政法大学,法律,2003,硕士.
[34]穆爽.管窥美国管道安全[J].中国石油企业,2004,06:48-49.
[35]张越.冀京津地区甲虫物种多样性与区系分布[D].河北大学,动物学,2014,硕士.
[36]李程前.认知翻译学视域下记者招待会中的交替传译研究[D].内蒙古大学,翻译,2014,硕士.
[37]栗军涛.基于PET/CT医学影像肺部肿瘤边界的研究[D].青岛大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[38]包志康.羽毛角蛋白负载的钯纳米颗粒：制备、表征及其催化水相中Suzuki偶联反应的研究[D].西北师范大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[39]陈晓蓉.杨维桢书学思想及书法实践研究[D].首都师范大学,美术学,2014,硕士.
[40]崔蕾.不同产地引种玉竹品质评价及病虫害防治试验研究[D].湖南中医药大学,中药学,2013,硕士.
[41]程青.职业高中作文仿写训练研究[D].河北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[42]叶松,吴本寿.中兴通讯TD-SCDMARNC产品介绍[J].电信网技术.2004(07)
[43]甄浩.邢台市高校篮球文化现状及策略研究[D].河北师范大学,体育教学,2014,硕士.
[44]林琳.精神血脉的影像表征[D].曲阜师范大学,艺术学,2013,硕士.
[45]周蕾.双重意识下的身份寻求[D].湖南师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[46]谢毅.类石墨烯化学中的挑战及机遇[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——大会邀请报告[C].中国化学会:,2014:1.
[47]吕超贤,李欣然,户龙辉,尹丽,胡京.基于小波分频与双层模糊控制的多类型储能系统平滑策略[J].电力系统自动化,2015,02:21-29.
[48]林婷婷.乘员人体骨骼系统参数化建模研究[D].吉林大学,机械工程,2014,硕士.
[49]周爱平.石墨烯量子点的电子结构及光学和磁学性质的研究[D].复旦大学,理论物理,2013,博士.
[50]郭又铭.基于两种分布的GARCH模型的估计及性质[D].兰州理工大学,运筹学与控制论,2013,硕士.