靶向VEGFR-1脱氧核酶抑制血管生成及肿瘤生长的实验研究

【摘要】现代肿瘤治疗已经从传统的手术、放疗、化疗治疗模式向综合型治疗模式转变。分子靶向药物的作用已经开始凸现,其中血管生成抑制剂通过阻断血管形成来抑制肿瘤的生长是目前应用前景可观的一种治疗策略。脱氧核酶是基因治疗技术的一种崭新的分子生物学工具,通过将RNA分子在配对的嘧啶和未配对的嘌呤之间切断,从而调控基因的表达。本研究通过针对VEGFR-1mRNA设计合成10-23型脱氧核酶,观察其在体内外阻断血管生成的作用,并通过小鼠黑色素瘤模型、人鼻咽癌移植瘤模型评价10-23型脱氧核酶DT18的生物学效应。研究表明,靶向VEGFR1的脱氧核酶具有抗肿瘤尤其是治疗鼻咽癌的临床应用前景。第一部分目的：靶向VEGFR-1mRNA脱氧核酶的设计及生化鉴定。方法：通过insilico设计针对血管内皮生成因子受体VEGFR-1的10-23DNAzyme。合成硫代化修饰的脱氧核酶,通过体外切割实验、小管形成实验筛选出活性良好的脱氧核酶,并以动力学实验分析其生化活性。活性脱氧核酶经TMP转染HUVEC,倒置显微镜观察HUVEC对FITC荧光素标记的脱氧核酶的摄取,流式细胞仪检测转染效率,免疫印迹检测脱氧核酶的生物学活性。结果：针对不同区域的靶位点设计了靶向VEGFR-1mRNA序列11条,分别合成10-23DNAzyme。通过体外切割实验、小管形成实验筛选到活性良好的脱氧核酶DT18。动力学参数分析实验显示DT18对底物在50秒就开始发生作用,且随着时间的延长,切割产物也随之增多。DT18经TMP转染后24h即可在显微镜下看见约50%的细胞发出绿色荧光,流式细胞仪检测转染效率为80%；免疫印迹检测发现DT18能明显抑制VEGFR-1的表达。相对于对照组,实验组的小管形成能力明显减弱。结论：成功筛选到活性良好的靶向VEGFR-1mRNA的脱氧核酶。第二部分目的：体内水平探讨10-23脱氧核酶DT18抑制血管新生的生物学效应。方法：实验分为三组：脱氧核酶组(DT18group)、寡核苷酸对照组(INV-Ctrlgroup)和生理盐水组(salinegroup)。通过角膜微囊袋法建立鼠角膜血管形成模型,在显微镜下观察DT18对角膜新生血管面积和数量的影响；建立黑色素瘤细胞B16移植瘤小鼠肿瘤模型,观察DT18是否通过靶向VEGFR-1影响肿瘤生长；DT18细胞转染入B16细胞,MTT实验检测DT18对细胞增殖的影响。结果：DT18明显抑制了角膜血管的新生,相对于生理盐水组,实验组减少了72%的血管面积和61%的血管数量。与对照组、生理盐水组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。成功构建血管丰富且VEGFR-1高表达的黑色素瘤移植鼠模型。利用该模型,DT18明显抑制了肿瘤的生长,相对于对照组与生理盐水组,各组肿瘤体积的差异具有统计学意义(P<0.05)。利用转染试剂Fugene成功将DT18细胞转染入B16细胞,48h后在荧光显微镜下可见到80%的细胞发出绿色荧光,MTT实验证实DT18不影响细胞的增殖(P>0.05)。结论：成功建立了鼠角膜血管形成模型、黑色素瘤小鼠模型；并以体内实验模型验证了经过硫代化修饰的10-23DNAzymeDT18通过靶向VEGFR-1明显抑制血管新生,进而抑制肿瘤生长。第三部分目的：利用分子影像学手段探讨靶向VEGFR1’脱氧核酶对鼻咽癌移植瘤血管通透性和血管生成的影响。方法：将鼻咽癌移植瘤裸鼠模型随机分为3小组：脱氧核酶组(DT18group)、寡核苷酸对照组(INV-Ctrlgroup)、生理盐水组(salinegroup)。待肿瘤体积长至60-100mm3后进行肿瘤内注射用药,肿瘤内每周两次多点注射20μ1的注射液,包含3μl的fugene口100μg的DT18(或生理盐水或者INV-CONTROL),共给药7次,第18天终止实验,期间测量肿瘤大小和小鼠体重。并于干预结束后行常规MRI和DCE-MRI,获得移植瘤肿瘤组织的Ktrans值。移植瘤标本分别行VEGFR1免疫组化染色。结果：反映肿瘤血管通透性的Ktrans值在脱氧核酶处理组与寡核苷酸对照组、生理盐水组与移植瘤肿瘤组的差别有统计学意义(实验组和对照组比较P=0.028,实验组和生理盐水组比较P=0.026)。脱氧核酶处理组与寡核苷酸对照组、生理盐水组移植瘤体积变化的差别有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果表明,脱氧核酶处理组VEGFR1表达显著低于,寡核苷酸对照组和生理盐水对照组。结论：结合免疫组化和Ktrans值证实靶向VEGFR1mRNA脱氧核酶可导致鼻咽癌移植瘤血管生成和血管通透性下降,移植瘤肿瘤体积减小。其病理生理学基础是靶向VEGFR1脱氧核酶在移植瘤内能够通过抑制VEGFR1的表达来抑制血管新生,从而抑制肿瘤生长Ktrans值可为探讨靶向EBV-VEGFR1mRNA脱氧核酶进行鼻咽癌的临床实验提供实验依据。第四部分目的：靶向VEGFR-1mRNA脱氧核酶DT18的药代动力学及安全性初步评价。方法：1.药代动力学分析：32p标记的DT18(1mg/ml2001)通过尾静脉注射Balb/c鼠,注射剂量为10mg/kg,,在不同的时间点(3只鼠/时间点)分别通过眼眶静脉丛穿刺采血法抽取0.5ml外周血。离心获取血清,并通过苯酚/氯仿萃取DT18。用Southern印迹和标准曲线对DT18浓度进行定量检测。药代动力学参数通过软件计算。2.毒理分析：将30只Balb/C鼠随机分为生理盐水组(Saline组10只)、对照组(INV-Ctrl组10只)和实验组(DT18组10只),每只老鼠均给予单次尾静脉注射,DT18组和INV-Ctrl组剂量为20mg/kg。给药2周内评估各组老鼠的体重变化、摄食情况,两周后收集小鼠外周血液,行血常规、肝肾功能、免疫功能检查,检测主要脏器指数并行主要脏器病理学检查。结果：1.DT18以10mg/kg的剂量经尾静脉注射入小鼠体内,实验期间大鼠未见明显异常行为。通过药代动力学软件计算,分布半衰期为0.1hr,消除半衰期为46.7hr,最大血药浓度为84.4mg/ml,药物浓度-时间曲线下面积为97mg/mlhr,表观分布体积为890ml/kg。2.各组大鼠在给药期间和恢复期未出现毒性反应和死亡现象,DT18组体重变化、脏器指数、摄食情况、血常规、肝肾功能、淋巴细胞CD3+/CD4+/CD8+比例以及主要脏器病理检查与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：DT18具有良好的较好的药物耐受性和安全性,具有潜在的临床应用前景。
【作者】周琴；
【导师】申良方；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】血管生成；新生血管；脱氧核酶；黑色素瘤；鼻咽癌；

【参考文献】
[1]杨云燕.公共危机治理中社会资本的运用研究[D].中国矿业大学,行政管理,2014,硕士.
[2]张宜媛.中建八局施工项目成本管理研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[3]李永双.鸡输卵管特异性启动子的优化研究[D].南京农业大学,动物遗传育种与繁殖,2011,硕士.
[4]吴敌.论刑法中的被害人承诺[D].河北经贸大学,刑法学,2012,硕士.
[5]宁水根.基于试验分析的电动汽车再生制动性能研究[D].华侨大学,车辆工程,2013,硕士.
[6]李学东.实施数据挖掘提高国有商业银行的竞争力[J].辽宁经济,2005,08:53.
[7]樊琦.契约控制与快速信任影响创新联盟形成绩效实证研究[D].河北经贸大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[8]牛洪全.S216线察汗淖至敖勒召其镇公路建设经济可行性研究[D].吉林大学,交通运输工程,2012,硕士.
[9]王勇.吉林省通信公司运营分析与决策支持系统建设方案[D].吉林大学,2005.
[10]蒙西,乔俊飞,韩红桂.基于ART的RBF网络结构设计[J].控制与决策,2014,10:1876-1880.
[11]毛伟吉.高强度PC钢棒的热处理工艺及合金化研究[D].中国地质大学（北京）,材料工程,2012,硕士.
[12]张小蒙.股权结构对企业R&D投入的影响研究[D].东北财经大学,财务管理,2012,硕士.
[13]宋江春,陈文林.Web使用挖掘及其在远程教育教学支持服务中的应用研究[J].中国远程教育,2005,07:62-64.
[14]王倩.信息化在制造企业发展中互动关系的实证研究[D].首都经济贸易大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[15]方荔华.西安市能源构成与环境空气质量的相关性研究[D].西安建筑科技大学,环境工程,2004,硕士.
[16]马森.我国伪证罪司法认定之疑难问题研究[D].扬州大学,法律,2012,硕士.
[17]马丽.现代信息技术优化化学实验教学研究[D].东北师范大学,现代教育技术,2012,硕士.
[18]崔涛.心血管病患者拔牙牙科焦虑症的流行病学调查及其对心血管系统的影响[D].第四军医大学,口腔临床医学,2004,硕士.
[19]格根陶格斯.赛春嘎初期两部文集的文献比较研究[D].内蒙古师范大学,中国古典文献学,2013,硕士.
[20]倪建军,马小平,王耀才.数据挖掘技术在工业控制系统中的应用研究[J].工业控制计算机,2004,03:5-8.
[21]桂晓露,郭峰,高古辉,罗开双,白秉哲.Cr对低合金MnCrB系贝氏体铸钢组织及耐磨性能的影响[J].铸造,2015,02:101-104.
[22]董晓杰.从《全国工业复兴法》到《国家劳工关系法》[D].浙江大学,法学,2012,硕士.
[23]李慧.我国地方性政府支出对城乡居民消费影响的实证分析[D].南京大学,政治经济学,2013,硕士.
[24]李晓卉.络合法以及固定化酶法制备D-塔格糖的研究[D].江南大学,食品科学,2012,硕士.
[25]刘云贺.大落差前轴精细制坯辊锻—整体模锻成形工艺研究[D].太原科技大学,材料加工工程,2014,硕士.
[26]刘昱.Li掺杂SnO_2d~0磁性的第一性原理研究[D].吉林大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[27]谭然.欲望时代的精神坚守[D].安徽大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[28]秦帅.我国韩国语教材的汉字词分析[D].青岛大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[29]刘刚.MIMO-OFDM系统中信道估计技术的研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2003,硕士.
[30]闻小刚.阳离子分散松香胶的制备工艺及其改性研究[D].江西农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[31]李胜男.以中国学习者为对象的韩国语疑问终结词尾教育方案研究[D].山东大学,亚非语言文学,2013,硕士.
[32]于腾.基于改进小波变换的微地震信号噪声压制技术研究[D].吉林大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[33]万泉攸.我国基层人大直接选举制度及其完善[D].宁波大学,宪法学与行政法学（专业学位）,2013,硕士.
[34]梁文婧.《现代汉语词典》认知类指人名词研究[D].大连理工大学,语言学与应用语言学,2013,硕士.
[35]王建民,刘杰烈,陈守田,许建军,王雪艳,周志才,孙长赞.海拉尔盆地岩性地震勘探技术及应用[J].石油地球物理勘探,2009,02:219-224+128-129+255.
[36]黄仕靖.采购行为的归因与激励约束研究[D].南京大学,物流工程（专业学位）,2013,硕士.
[37]牛青.基于UML的编程考试系统的设计与分析[D].西安电子科技大学,计算机技术,2010,硕士.
[38]江岑.广播电视编辑胜任力模型建构[D].扬州大学,应用心理学,2011,硕士.
[39]宋晓伟.热熔套管护壁用热熔头外壳研制与实验研究[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[40]肖鸿.基于系统动力学的北京市物流系统分析及优化建议[D].北京交通大学,系统工程,2013,硕士.
[41]顾幸雨.传统装饰艺术对现代插画艺术创作的启示研究[D].西安美术学院,设计艺术学,2014,硕士.
[42]肖丽.统计技术在高分子材料及其制件研制和生产过程中的应用研究[D].四川大学,材料工程,2003,硕士.
[43]李旭丹.河南省沥青路面弯沉值季节影响系数的确定研究[D].长安大学,交通运输工程,2013,硕士.
[44]汪凤姣.城市滨水区植物景观视觉设计研究[D].中南林业科技大学,风景园林,2013,硕士.
[45]吴管鹏.农村低保分配演变过程及其启示[D].华中师范大学,农业推广,2014,硕士.
[46]陆方军.基于ASP.NET的某工程公司项目管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[47]成玫.厦门地区传统民居的建筑语言的解读及研究[D].湖南大学,建筑与土木工程,2010,硕士.
[48]左峰.基于下垂控制的并网逆变器辅助控制功能研究[D].东北电力大学,电气工程,2013,硕士.
[49]李玥.西安市“城中村”改造模式探讨[D].西安建筑科技大学,建筑设计及理论,2004,硕士.
[50]杨鹏1,2,刘豆1,王汝言1,闫俊杰1.节点剩余能量均衡的机会网络路由机制[J].系统工程与电子技术.