RASSF1A基因在骨肉瘤中抑癌机制研究及其与Wnt信号通路关系

【摘要】目的：骨肉瘤是由具有成骨潜能的骨间叶组织发展而来的恶性结缔组织瘤,也是原发性恶性骨肿瘤之中发病率最高肿瘤之一。骨肉瘤有高度软组织侵袭性以及远处转移倾向,在临床表现出高度恶性。RASSF1A是新近发现的抑癌基因,在骨肉瘤等多种肿瘤细胞中由于其启动子区高度甲基化导致表达缺失,但其对于骨肉瘤的抑癌作用及抑癌作用机制尚未阐明。本研究探讨RASSF1A基因对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移及侵袭的影响,并在此基础上研究RASSF1A基因对骨肉瘤增殖迁移相关Wnt/β-catenin信号通路的作用,希望通过上述工作促进骨肉瘤靶向治疗的开展。方法：本项目构建抑癌基因RASSF1A重组腺病毒并感染骨肉瘤细胞,在细胞水平探讨RASSF1A基因与骨肉瘤的关系。首先利用免疫印迹法(WesternBlot)检测几种骨肉瘤细胞系中RASSF1A蛋白的表达情况；在没有RASSF1A基因表达的骨肉瘤细胞系MNNG/HOSCl中,利用腺病毒载体过表达RASSF1A,检测RASSF1A基因过表达对骨肉瘤增殖(MTT实验)、细胞周期、凋亡(流式实验)、迁移和侵袭(Transwell小室实验)的影响；定量PCR的方法分析RASSF1A对于骨肉瘤相关基因MMP7、C-myc、CyclinDl表达的影响。通过免疫印迹法分析RASSF1A对Wnt/β-catenin信号通路中几个关键蛋白的表达和磷酸化的影响；最后利用骨肉瘤裸鼠皮下成瘤模型对RASSF1A的抑癌作用进行了初步研究。结果：成功构建腺病毒穿梭载体pYr-Ads-4-shutter-RASSF1A,并通过腺病毒重组技术获得有感染能力的过表达RASSF1A基因的腺病毒。证明RASSF1A基因在不同来源的骨肉瘤细胞系中表达有差异,Saos-2及MNNG/HOSC1细胞系中低表达。进一步实验证明ASSF1A基因能够引起骨肉瘤细胞MNNG/HOSCl的细胞G1/S期阻滞、引起细胞增殖速度降低并促进细胞凋亡。同时感染RASSF1A腺病毒的MNNG/HOSC1细胞与对照腺病毒细胞相比,其侵袭、迁移能力也都明显受到抑制,并且MMP7、C-myc、CyclinD等促进肿瘤细胞增殖、迁移以及侵袭的关键基因表达量下调。细胞信号通路分析发现在骨肉瘤细胞系MNNG/HOSCl中过表达RASSF1A基因导致Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin的降解和入核蛋白量减少,β-catenin的上游关键蛋白GSK3β磷酸化程度下降,MST1/MST2磷酸化水平上升。裸鼠皮下成瘤模型推测RASSF1A可能抑制肿瘤的生长。结论：RASSF1A在骨肉瘤细胞系MNNG/HOSCl中过表达之后能够抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭,同时促进骨肉瘤细胞凋亡及引起细胞周期阻滞。RASSF1A通过抑制GSK3β磷酸化和促进β-catenin的降解,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。这一系列的研究结果将为基于RASSF1A的骨肉瘤特异靶向性基因治疗方案以及临床运用提供坚定的理论基础。图36幅,表10个,参考文献126篇。
【作者】臧晓方；
【导师】黄祖发；张朝跃；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】骨肉瘤；基因治疗；RASSF1A；抑癌基因；腺病毒；Wnt信号通路；

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