CDKN2A与EGFR基因在胶质细胞瘤中的表达及对化疗敏感性的影响

【摘要】摘要：目的1.探讨CDKN2A在胶质瘤中的表达及其在胶质瘤发生、发展过程中的作用机制；2.探讨EGFR基因在胶质瘤中的表达及其对化疗敏感性的影响；3.了解促进CDKN2A过表达、干扰EGFR表达在抑制胶质瘤生长及增强化疗敏感性方面是否具有协同作用。方法(一)1.选取中南大学湘雅二医院2007～2011年61例神经胶质细胞瘤患者肿瘤组织作为研究标本,所有病例未进行术前化疗和放疗；2.分别用免疫组化及Westernblot方法检测神经胶质瘤组织及神经胶质瘤细胞系U251-MG、T98G、U87-MG、A172、SW1783、U118-MG、U138-MG、H4和HS-683中CDKN2A的表达,经统计学分析CDKN2A在不同胶质瘤病例和胶质瘤细胞系中的表达量与胶质瘤恶性程度之间的关系；3.利用空载体或CDKN2A重组表达载体转染胶质瘤细胞系,应用免疫组化及Westernblot方法检测转染后CDKN2A的表达,倒置显微镜观察转染CDKN2A后神经胶质瘤细胞系形态及生长变化,进行细胞集落计数,绘制生长曲线；4.设计合成CDKN2A特异的siRNA,应用siRNA沉默胶质瘤细胞系HS-683和H4中CDKN2A,Westernblot方法检测细胞中CDKN2A、CyclinD和pRb蛋白的表达,倒置显微镜观察和活细胞计数分析siRNA沉默CDKN2A的表达后神经胶质瘤细胞系形态及生长变化,进行细胞集落计数,绘制生长曲线；5.在siRNA沉默CDKN2A的表达后神经胶质瘤细胞中加入CyclinD1抑制剂-flavopiridol,倒置显微镜观察胶质瘤细胞形态变化,进行细胞集落计数,绘制生长曲线,并利用Westernblot方法检测pRb蛋白的磷酸化水平和cyclinD1表达变化；(二)1.分别用免疫组化及Westernblot方法检测上述61例神经胶质瘤患者肿瘤组织中EGFR的表达,经统计学分析EGFR在不同胶质瘤病例中的表达与胶质瘤恶性程度之间的关系；2.用EGFR-siRNA沉默U251细胞EGFR表达,倒置显微镜观察慢病毒干扰EGFR表达后U251细胞形态及生长变化,进行细胞集落计数,绘制生长曲线；3.MTT法分别检测EGFR干扰组-RNAi,BCNU处理组-BCNU,联合组-BCNU+RNAi和空白组的胶质瘤细胞生长增殖的变化,并进行统计学分析；(三)1.利用基因修饰技术,建立联合CDNK2A过表达和干扰EGFR表达的胶质瘤细胞模型,倒置显微镜观察胶质瘤细胞形态及生长变化；2.MTT法分别检测对照干扰组、EGFR干扰组、CDKN2A转染组及CDKN2A转染和EGFR干扰联合组的胶质瘤细胞分别在相同浓度的BCNU作用下生长增殖的变化,并进行统计分析。结果(一)1.CDKN2A在不同恶性程度的胶质瘤肿瘤组织中表达量不同,在低分化胶质瘤患者的肿瘤组织中CDKN2A表达量显著低于高分化胶质瘤患者；同样,在不同恶性级别的胶质瘤细胞株中,高级别胶质瘤细胞中的表达水平亦显著低于低级别胶质瘤细胞；2.CDKN2A过表达可以有效的抑制集落形成活性和降低细胞生长率；3.siRNA沉默CDKN2A的表达后肿瘤细胞生长速度明显增高,而flavopiridola可以逆转这种作用,从而延缓HS-683和H4细胞株的生长；4.siRNA沉默CDKN2A的表达后肿瘤细胞降低pRb磷酸化和细胞周期蛋白cyclinD1的表达,同样flavopiridola可以逆转这种趋势；5.与较低级别胶质瘤细胞系相比,cyclinD1在高级别胶质瘤细胞系中的表达水平增高。(二)1.在不同级别胶质瘤组织中,EGFR在高级别胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别脑胶质瘤；2.靶向干扰EGFR的表达可以显著抑制胶质瘤细胞系U251增殖活性,增强其对化疗药物BCNU的化疗敏感性。(三)EGFR干扰组、CDKN2A转染组均可以有效的抑制U251胶质瘤细胞的生长率,而CDKN2A转染和EGFR干扰联合组亦可以抑制胶质瘤细胞的增殖,并且显著优于其它各组。结论1.CDKN2A的表达量与胶质瘤的恶性程度呈负相关,而EGFR的表达量与胶质瘤的恶性程度呈正相关；2.在恶性胶质瘤细胞周期中,可能存在CDKN2A表达水平负反馈机制,其抗肿瘤作用对cyclinD1具有依赖性,该位点的突变和缺失在神经胶质瘤肿瘤的发生、发展中发挥着关键作用；3.CDKN2A过表达和靶向干扰EGFR的表达均可增强胶质瘤细胞对BCNU的化疗敏感性,并且两者具有协同作用,证实联合基因治疗胶质瘤可以提高治疗的有效性,从而弥补单基因治疗的不足,为新药研发及制定新的治疗方案提供了可靠的理论基础。
【作者】李亚伟；
【导师】熊光仲；王冰；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】胶质瘤；CDKN2A；EGFR；卡莫司汀；化疗敏感性；

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