SIN1通过调控上皮细胞间质转化促进肝细胞癌侵袭转移

【摘要】原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最为常见的恶性肿瘤之一。其发病率居男性恶性肿瘤的第五位,死亡率居男性恶性肿瘤第二位。全球每年新发病例约748300人,年死亡病例达695900人。随着肝脏外科技术的进步,肝癌的手术治疗水平已有显著提高,但其术后5年复发转移率仍高达70%,严重制约了肝癌患者整体治疗水平的提高。因此,深入研究肝癌复发转移的机制,探索有效的预防和治疗复发转移的手段是当今肝癌研究的热点,对于进一步提高肝癌患者整体治疗水平具有十分重要的意义。应激活化蛋白激酶作用蛋白1(SAPKinteractingprotein1,SIN1)新近发现的胚胎发育关键蛋白。SIN1被认定为TORC2关键组成成分,可通过调控AKT磷酸化影响AKT下游信号通路。众所周知,AKT信号通路对包括肝癌在内的恶性肿瘤的侵袭转移发挥着重要的作用,尤其是近年来大量研究发现AKT信号通路可以调控上皮细胞间质转化,从而促进肿瘤转移。这些均提示SIN1很可能在肝癌的侵袭转移中发挥重要作用。为此,本课题试图研究SIN1在肝癌组织样本及肝癌细胞系中表达水平,并结合随访资料,分析SIN1与肝癌临床病例特征的关联以及SIN1与肝癌患者生存预后的关系。我们利用siRNA干扰技术在肝癌细胞系中抑制SIN1的表达,从体外和体内研究SIN1对肝癌侵袭转移的作用,并探讨了SIN1对肝癌上皮细胞间质转化的调控作用。以期阐明SIN1在肝癌侵袭转移中的作用及其作用机制。我们的研究结果表明：1.SIN1mRNA和蛋白在肝癌组织和肝癌细胞系中显著高表达首先我们通过实时定量PCR检测了30对肝癌组织以及相应癌旁组织中SIN1mRNA的表达水平,结果显示SIN1mRNA在肝癌组织中显著高表达(中位值为2.2倍)。通过westernblot检测SIN1蛋白在肝癌组织以及相应癌旁组织中的表达,结果表明SIN1蛋白在肝癌组织中的表达水平显著高于邻近非癌肝组织(P<0.05)。通过进一步分层分析我们发现,SIN1在孤立性大肝癌(SLHCC)中的表达水平显著低于结节性肝癌(NHCC)(P=0.016),而与小肝癌(SHCC)之间则没有显著差别(P>0.05)。我们进一步采用real-timePCR和westernblot检测了SIN1mRNA及蛋白在正常肝细胞系L02,以及五种不同的肝癌细胞系HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和3MMC-7721中的表达水平。实验结果显示：SIN1在肝癌细胞系中的表达水平显著高于正常肝细胞系LO2(P<0.05),且SIN1在肝癌细胞系中的表达水平随着各肝癌细胞系侵袭转移潜能的增强而增高,提示SINl与肝癌的侵袭转移密切相关。同时,我们还选取了SIN1表达水平最高的HCCLM3和MHCC97-H细胞系作为下一步的研究对象。2.SIN1表达水平与肝癌临床病理特征及预后的关系通过免疫组化检测SIN1在60对肝癌组织和相应癌旁组织中的表达,结果同样表明其在肝癌组织呈显著高表达,且SIN1高表达组的总体生存率和无瘤生存率均显著低于SIN1低表达组(P<0.05),提示SIN1高表达组的肝癌病人预后较差。而且研究尚发现SIN1表达水平与肿瘤结节个数(P=0.012),包膜形成(P=-0.037),血管浸润(P=0.023),及TNM分期(P=0.020)密切相关。3.SIN1在体外能显著增强肝癌细胞的运动和侵袭能力为了研究SIN1在体外对肝癌细胞运动和侵袭能力的影响,我们首先构建了SIN1siRNA,通过慢病毒转染SIN1相对高表达的HCCLM3和MHCC97-H细胞系,采用westernblot验证SIN1siRNA干扰效率。通过划痕愈合实验和Transwell侵袭小室实验研究SIN1对肝癌细胞系HCCLM3和MHCC97-H侵袭运动能力的影响。划痕愈合实验结果显示HCCLM3SIN1-RNA1迁移运动能力较HCCLM3NC细胞明显减弱(95%versus45%,P<0.05);Transwell实验结果显示HCCLM3SIN1-RNAi细胞侵袭能力较HCCLM3NC细胞明显下降(161±8versus56±13,P<0.05)；同样,在MHCC97-H细胞系中也得到了相似的结果(P<0.05)。提示下调SIN1的表达可显著抑制肝癌细胞的侵袭运动能力。4.SIN1在体内能促进肝癌转移为了研究SIN1在体内对肝癌侵袭转移的作用,我们构建了人肝癌细胞裸鼠肝脏原位种植模型。我们选择侵袭转移潜能最强同时也是SIN1表达水平最高的细胞系HCCLM3来进行研究,结果显示,HCCLM3SIN1-RNAi组肝癌肝内转移结节数目较HCCLM3NC组明显减少(7±3versus15±5,P<0.05),明显提示降低SIN1表达水平可以明显抑制肝癌在裸鼠体内的转移。5.SIN1调控上皮细胞间质转化已有的研究表明SIN1是调控AKT磷酸化的关键蛋白,而大量研究证实AKT磷酸化对上皮细胞间质转化发挥了非常重要的调控作用。由此,我们推测SIN1很可能通过调控AKT磷酸化参与了肝癌上皮细胞间质转化,从而促进肝癌侵袭转移。为此,我们在HCCLM3和MHCC97-H两个肝癌细胞系中开展了一系列研究。结果表明降低HCCLM3和MHCC97-H细胞系中SIN1的表达水平后AKT磷酸化明显减少(P<0.05)。而且上皮细胞间质转化相关蛋白Snail,Vimentin,N-cadherin,MMP9的表达亦明显减少(P<0.05),而E-cadherin的表达则显著增高(P<0.05)。在HCCLM3SIN1-RNAi和MHC97-HSIN1-RNAi细胞中过表达Snail后肝癌细胞的侵袭转移能力得到明显恢复。以上结果提示SIN1是通过调控上皮细胞间质转化发挥其促进肝癌侵袭转移的作用。基于上述研究结果我们得出以下结论：SIN1在肝癌组织中呈显著高表达,且其表达水平与肿瘤结节个数、包膜形成、血管浸润以及TNM分期密切相关,并显著影响肝癌患者的预后。抑制SIN1表达水平可以显著抑制肝癌的侵袭转移。SIN1通过调控上皮细胞间质转化促进肝癌侵袭转移。SINl是一个潜在的肝癌侵袭转移治疗靶点。
【作者】徐江锋；
【导师】杨连粤；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】SIN1；肝细胞癌；上皮细胞间质转化；侵袭转移；预后；

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